Wie beeinflussen Zellsiebe die Erfolgsrate der Einzelzellsequenzierung?

Die Einzelzell-Sequenzierung ermöglicht es Forschenden, zelluläre Heterogenität und molekulare Eigenschaften auf der Ebene einzelner Zellen zu untersuchen. Die Qualität der anfänglichen Einzelzell-Suspension ist entscheidend, da die Gewebedissoziation Zellaggregate, Gewebefragmente und Zelltrümmer erzeugen kann. Zellsiebe helfen, diese unerwünschten Bestandteile zu entfernen und eine sauberere, gleichmäßigere Zellsuspension zu erzeugen, wodurch eine bessere Ausgangsprobe für die Zellzählung, den Einzelzell-Einfang und die nachgelagerte Sequenzierung bereitgestellt wird.

Was ist ein Zellsieb?

A Zellsieb Ein Zellsieb ist ein Labormaterial, das dazu dient, einzelne Zellen von größeren Partikeln, Gewebefragmenten, Zellaggregaten und anderen unerwünschten Partikelmaterialien in einer biologischen Probe zu trennen. Es besteht typischerweise aus einem Stützrahmen und einem porösen Netz oder einer Membran mit einer definierten nominalen Porengröße. Zellsiebe führen in erster Linie eine physikalische Filtration auf Basis der Größe durch. Wenn eine Zellsuspension durch das Netz fließt, können Flüssigkeit und Zellen geeigneter Größe die Poren passieren, während größere Gewebefragmente, Zellcluster und Partikelmaterialien zurückgehalten werden.

Zellsiebe sind besonders nützlich bei der Herstellung von Einzelzell-Suspensionen aus Geweben oder anderen komplexen biologischen Proben. Die Gewebedissoziation, ob mechanisch oder enzymatisch, erzeugt selten eine vollständig gleichmäßige Suspension. Stattdessen kann die resultierende Probe einzelne Zellen zusammen mit Zellaggregaten, unvollständig dissoziiertem Gewebe, extrazellulären Matrixkomponenten, Trümmern abgestorbener Zellen und anderen Partikeln enthalten. Durch die Entfernung relativ großer unerwünschter Materialien kann ein Zellsieb dazu beitragen, eine gleichmäßigere Suspension für die anschließende Zellzählung, Vitalitätsbewertung, Zellsortierung, Durchflusszytometrie, Einzelzell-Analyse oder Sequenzierung zu erzeugen.

Häufige Anwendungen von Zellsieben

Zellsiebe werden häufig verwendet in:

• Gewebedissoziation
• Primärzell-Isolierung
• Zellkultur
• Durchflusszytometrie-Probenvorbereitung
• Immunologieforschung
• Stammzellenforschung
• Organoid-Verarbeitung
• Zellsortierung
• Einzelzell-Sequenzierungs-Probenvorbereitung

Die spezifische Rolle des Siebs hängt von der Anwendung ab. Beispielsweise kann bei der Gewebedissoziation der Hauptzweck darin bestehen, unverdaute Gewebefragmente und Zellaggregate zu entfernen. In der Durchflusszytometrie kann die Filtration dazu beitragen, das Vorhandensein großer Partikel zu reduzieren, die die Probenbeladung oder den Instrumentenbetrieb stören könnten. Bei der Einzelzell-Sequenzierung wird die Filtration üblicherweise als vorgelagerter Probenvorbereitungsschritt verwendet, um eine relativ gut dispergierte Zellsuspension zu erhalten.

Aufbau eines Zellsiebs

Die meisten Zellsiebe bestehen aus zwei grundlegenden Komponenten: einem Stützrahmen und einem porösen Netz.

Der Stützrahmen bietet mechanische Stabilität und ermöglicht es, das Sieb über einem Zentrifugenröhrchen, Kulturgefäß, Sammelröhrchen oder einem anderen Behälter zu positionieren. Je nach Produktdesign kann der Rahmen aus laborverträglichen Polymeren wie Polypropylen (PP) hergestellt sein.

Das poröse Netz ist die funktionale Filtrationskomponente. Es enthält regelmäßig verteilte Öffnungen mit einer definierten nominalen Porengröße. Das Netz hält Partikel zurück, die die Öffnungen nicht passieren können, während es Flüssigkeit und Zellen geeigneter Größe durchlässt.

Je nach Design können Zellsiebe geliefert werden als:

• Röhrchenaufsatz-Zellsiebe, die direkt auf Zentrifugen- oder Sammelröhrchen passen
• Eigenständige Zellsiebe, die mit Schalen, Flaschen oder anderen Gefäßen verwendet werden können
• Zentrifugenkompatible Filtrationseinheiten, die für Arbeitsabläufe entwickelt wurden, die Filtration und Zentrifugation kombinieren
• Integrierte Filtrationsvorrichtungen, bei denen das Sieb in ein größeres Probenverarbeitungssystem integriert ist

Das geeignete Format hängt von Probenvolumen, Arbeitsablaufdesign, Sammelgefäß und nachgelagerter Anwendung ab.

Häufige Porengrößen

Häufige Porengrößen von Zellsieben umfassen etwa 40 μm, 70 μm und 100 μm, obwohl andere Porengrößen für spezielle Anwendungen verfügbar sind.

• Ein 40-μm-Zellsieb bietet eine relativ feine Filtration und kann geeignet sein, wenn eine hochgradig gleichmäßige Zellsuspension erforderlich ist. Kleinere Poren können jedoch leichter verstopfen, wenn Proben große Mengen an Gewebetrümmern oder Zellaggregaten enthalten.
• Ein 70-μm-Zellsieb wird häufig als Allzweckoption für viele Gewebedissoziations- und Einzelzell-Suspensions-Arbeitsabläufe verwendet, da es ein praktisches Gleichgewicht zwischen Aggregatentfernung und Zellrückgewinnung bietet.
• Ein 100-μm-Zellsieb hat größere Poren und kann für Proben mit größeren Zellen, größeren Gewebefragmenten oder für Anwendungen nützlich sein, bei denen eine übermäßige Filtration durch kleinere Poren die Zellrückgewinnung verringern könnte.

Die optimale Porengröße sollte daher entsprechend dem Zielzelltyp, den Gewebeeigenschaften, der Dissoziationseffizienz, der Probenkonzentration und der nachgelagerten Anwendung ausgewählt werden.

Wichtig ist, dass die nominale Porengröße nicht als absolute biologische Trennschwelle interpretiert werden sollte. Ob eine Zelle ein Netz passiert, hängt nicht nur von ihrem Durchmesser ab, sondern auch von ihrer Form, Verformbarkeit, ihrem Aggregationszustand und den physikalischen Bedingungen während der Filtration.

Warum ist die Qualität der Einzelzell-Suspension wichtig?

Die Einzelzell-Sequenzierung ist darauf ausgelegt, molekulare Eigenschaften auf der Ebene einzelner Zellen zu messen. Um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen, müssen Zellen ausreichend dissoziiert, in einem geeigneten Zustand gehalten und effizient von großen Aggregaten und übermäßigen Trümmern getrennt werden, bevor sie in das Einzelzell-Verarbeitungssystem gelangen.

Eine ideale Einzelzell-Suspension sollte einen hohen Anteil an lebensfähigen, intakten und gut dispergierten Zellen enthalten, während große Zellaggregate, Gewebefragmente und andere Partikelmaterialien minimiert werden.

Die Qualität der Ausgangssuspension kann mehrere wichtige Stufen eines Einzelzell-Sequenzierungs-Arbeitsablaufs beeinflussen, einschließlich: Zellzählung; Zellvitalitätsbewertung; Zellbeladung; Einzelzell-Einfang; Tröpfchenerzeugung; Bibliotheksvorbereitung; Sequenzierungsdatenqualität; Nachgelagerte bioinformatische Analyse.

Probleme durch Zellaggregate

Eines der Hauptprobleme bei einer schlecht dispergierten Zellsuspension ist das Vorhandensein von Zellaggregaten. Ein Zellaggregat enthält zwei oder mehr Zellen, die nach der Gewebedissoziation physikalisch assoziiert bleiben. Wenn diese Aggregate in ein Einzelzell-Einfangsystem gelangen, können mehr als eine Zelle in demselben Reaktionskompartiment eingefangen werden. Bei der tröpfchenbasierten Einzelzell-Sequenzierung kann dies zu Dopplern oder Multiplern beitragen. Ein Doppler tritt auf, wenn zwei Zellen zusammen eingefangen werden und ihre molekularen Signale anschließend innerhalb derselben zellulären Partition detektiert werden. Ein Multiplet umfasst mehr als zwei Zellen.

Diese Ereignisse können die nachgelagerte Analyse erschweren, da das resultierende Genexpressionsprofil Signale enthalten kann, die von mehreren Zelltypen oder Zellzuständen stammen. Beispielsweise kann ein Profil, das eine ungewöhnliche Zellpopulation darzustellen scheint, tatsächlich aus zwei verschiedenen Zellen resultieren, die zusammen eingefangen wurden. Daher ist die Reduzierung übermäßiger Zellaggregation während der Probenvorbereitung ein wichtiger Teil der Gewinnung einer zuverlässigen Einzelzell-Suspension.

Auswirkungen von Gewebefragmenten und Zelltrümmern

Zusätzlich zu Zellaggregaten kann die Gewebedissoziation große Mengen an Zelltrümmern und extrazellulärem Material erzeugen. Diese Materialien können umfassen: Membranfragmente; Zerbrochene zelluläre Komponenten; Unverdautes Gewebe; Extrazelluläres Matrixmaterial; Trümmer abgestorbener Zellen; Freie Nukleinsäuren. Übermäßige Trümmer können die Zellzählung und Probenbeladung beeinträchtigen. Sie können auch das Hintergrundmaterial in der Probe erhöhen und es schwieriger machen, intakte Zellen von nicht-zellulären Partikeln zu unterscheiden.

In einigen Arbeitsabläufen können beschädigte oder lysierte Zellen intrazelluläre RNA in die umgebende Lösung freisetzen. Diese extrazelluläre RNA kann zu Umgebungs-RNA beitragen, die mit Tröpfchen oder anderen Reaktionskompartimenten assoziieren kann, die intakte Zellen enthalten. Umgebungs-RNA kann die Genexpressionsinterpretation erschweren, da Transkripte, die von beschädigten oder lysierten Zellen stammen, in anderen zellulären Partitionen detektiert werden können. Daher wird die Probenqualität nicht allein durch die Anzahl der gewonnenen Zellen bestimmt. Das Verhältnis von intakten Zellen zu Trümmern und Aggregaten ist ebenfalls wichtig.

Zellvitalität und Probenqualität

Die Zellvitalität ist ein weiterer wichtiger Parameter. Während der Gewebedissoziation und Probenvorbereitung können Zellen mechanischem Stress, enzymatischer Schädigung, längerer Verarbeitung, Temperaturschwankungen oder ungeeigneten Pufferbedingungen ausgesetzt sein. Diese Faktoren können den Zelltod erhöhen und den Anteil lebensfähiger Zellen verringern.

Ein hoher Anteil toter Zellen kann zu erhöhten Zelltrümmern und freien Nukleinsäuren führen, was die Probenqualität weiter verringert. Aus diesem Grund zielt die Einzelzell-Probenvorbereitung im Allgemeinen darauf ab, ein Gleichgewicht zu erreichen zwischen:

Hoher Zellrückgewinnung + hoher Zellvitalität + geringer Aggregation + geringen Trümmern

Eine hohe Gesamtzellzahl allein weist nicht unbedingt auf eine hochwertige Probe hin.

Warum Zellsieben hilft

Zellsiebe bieten eine relativ einfache physikalische Methode zur Reduzierung größerer unerwünschter Strukturen vor der nachgelagerten Verarbeitung.

Durch die Auswahl einer geeigneten Porengröße können Forschende zurückhalten: Große Gewebefragmente; Große Zellaggregate; Nicht dissoziiertes Material; Andere relativ große partikuläre Verunreinigungen. Während Zellen geeigneter Größe und die umgebende Flüssigkeit hindurchgelassen werden.

Dies kann die physikalische Gleichmäßigkeit der Zellsuspension verbessern und die Menge an großem partikulärem Material verringern, das in nachfolgende Verarbeitungsschritte gelangt. Das Zellsieben ist jedoch nur eine Komponente der Probenvorbereitung. Es kann eine geeignete Gewebedissoziation, Zellvitalitätskontrolle, Waschen, Konzentrationsanpassung oder andere notwendige Vorbereitungsschritte nicht ersetzen.

Wie funktionieren Zellsiebe?

Das Funktionsprinzip eines Zellsiebs basiert in erster Linie auf physikalischer Filtration und größenabhängiger Trennung. Nach der Gewebedissoziation enthält die resultierende Suspension biologische Strukturen mit unterschiedlichen physikalischen Abmessungen. Einzelne Zellen, Zellcluster, Gewebefragmente, extrazelluläres Material und Trümmer können in derselben Probe koexistieren. Wenn die Suspension durch das Sieb fließt, wirkt das Netz als physikalische Barriere. Flüssigkeit und Partikel, die ausreichend klein, geeignet geformt und in der Lage sind, die Öffnungen zu passieren, können sich durch das Netz bewegen, während größere Strukturen zurückgehalten werden.

Der grundlegende Arbeitsablauf kann wie folgt dargestellt werden:

Dissoziiertes Gewebe → Zellsuspension → Zellsieb → Filtrierte Zellsuspension → Nachgelagerte Analyse

• Die Rolle der Porengröße

Die Porengröße ist einer der wichtigsten Parameter, die die Filtrationsleistung bestimmen. Eine kleinere Porengröße bietet im Allgemeinen eine feinere physikalische Filtration und kann kleinere Aggregate und Partikel zurückhalten. Kleinere Poren neigen jedoch auch stärker dazu, verstopft zu werden, insbesondere bei der Verarbeitung von Proben mit hohen Konzentrationen an Gewebetrümmern oder Zellaggregaten. Eine größere Porengröße bietet im Allgemeinen eine höhere Durchflusskapazität und einen geringeren Widerstand gegen den Probendurchtritt. Größere Poren können jedoch auch einige größere Aggregate oder Gewebefragmente durchlassen. Daher sollte die Porengröße entsprechend dem beabsichtigten Filtrationszweck ausgewählt werden, anstatt einfach die kleinste verfügbare Porengröße zu wählen.

• Der Zellpassage wird nicht allein durch den Durchmesser bestimmt

Es ist wichtig zu verstehen, dass ein Zellsieb nicht als absolute molekulare oder zelluläre Trennschwelle funktioniert. Die Fähigkeit einer Zelle, eine Pore zu passieren, kann beeinflusst werden durch: Zelldurchmesser; Zellform; Zellverformbarkeit; Zellmembraneigenschaften; Aggregationszustand; Probenviskosität; Filtrationsdruck; Durchflussrate; Netzstruktur.

Beispielsweise kann eine einzelne verformbare Zelle unter bestimmten physikalischen Bedingungen eine Pore passieren, die kleiner ist als ihr statischer Durchmesser. Im Gegensatz dazu kann eine Gruppe von Zellen, die aneinander haften, zurückgehalten werden, selbst wenn jede einzelne Zelle dieselbe Pore passieren könnte. Folglich sollte die nominale Porengröße als standardisierte Filtrationsspezifikation interpretiert werden, nicht als strenge Vorhersage der genauen Größe jeder Zelle, die hindurchtritt.

• Filtration und Zellrückgewinnung

Eine der wichtigsten Überlegungen bei der Verwendung eines Zellsiebs ist das Gleichgewicht zwischen Partikelentfernung und Zellrückgewinnung. Wenn das Netz für eine bestimmte Probe zu fein ist, können einige Zielzellen zusammen mit unerwünschten Aggregaten zurückgehalten werden. Dies kann die endgültige Zellausbeute verringern. Wenn das Netz zu groß ist, kann eine unzureichende Entfernung von Aggregaten und Gewebefragmenten auftreten. Das Ziel ist daher nicht maximale Filtration, sondern angemessene Filtration.

Für Einzelzell-Anwendungen sollte ein effektiver Filtrationsschritt idealerweise erzeugen: Eine relativ gleichmäßige Zellsuspension; Reduzierte große Aggregate; Reduzierte Gewebetrümmer; Hohe Zielzell-Rückgewinnung; Minimale zusätzliche Zellschädigung.

• Einfluss der Probenkonzentration

Die Probenkonzentration kann das Filtrationsverhalten erheblich beeinflussen. Hochkonzentrierte Suspensionen enthalten mehr Zellen und Partikel pro Vol.

• Auswirkung des Filtrationsdrucks

Die Kraft, mit der die Suspension durch das Sieb gedrückt wird, kann ebenfalls das Ergebnis beeinflussen. Ein moderater und kontrollierter Durchfluss ist im Allgemeinen einem übermäßigen mechanischen Druck vorzuziehen. Übermäßiger Druck kann die Filtrationsgeschwindigkeit erhöhen, kann jedoch auch die mechanische Belastung empfindlicher Zellen erhöhen und möglicherweise die Zellintegrität beeinträchtigen. Für empfindliche Primärzellen oder andere fragile biologische Proben sollte der Filtrationsprozess daher sorgfältig und gemäß den Anforderungen des experimentellen Arbeitsablaufs durchgeführt werden.

• Warum die kleinste Porengröße nicht immer die beste Wahl ist

Ein häufiges Missverständnis ist, dass eine kleinere Porengröße automatisch eine bessere Einzelzellsuspension erzeugt. In der Realität beinhaltet die Filtrationsleistung einen Kompromiss zwischen:

Aggregatentfernung ↔ Zellrückgewinnung ↔ Filtrationsgeschwindigkeit ↔ Verstopfungsrisiko

Beispielsweise kann eine sehr kleine Porengröße zwar kleine Aggregate effektiv entfernen, kann jedoch auch: Verstopfung erhöhen; Filtrationswiderstand erhöhen; Verarbeitungsgeschwindigkeit verringern; einige gewünschte Zellen zurückhalten; die Gesamtzellrückgewinnung verringern. Umgekehrt kann eine größere Porengröße den Durchfluss und die Rückgewinnung verbessern, jedoch möglicherweise nicht ausreichend große Aggregate entfernen. Die geeignete Porengröße sollte daher entsprechend der biologischen Probe und der nachgelagerten Anwendung bestimmt werden.

Wie verbessern Zellsiebe die Qualität von Einzelzellsuspensionen?

• Entfernung von Geweberesten

Während der Gewebedissoziation wird die ursprüngliche Gewebestruktur mechanisch und enzymatisch aufgelöst, um einzelne Zellen freizusetzen. Eine vollständige Dissoziation ist jedoch nicht immer möglich, insbesondere bei dichten oder faserigen Geweben. Die resultierende Suspension kann daher undissoziierte Gewebefragmente, extrazelluläre Matrixbestandteile, Bindegewebsfasern und andere große partikuläre Materialien enthalten. Diese unerwünschten Bestandteile können die physikalische Qualität der Zellsuspension beeinträchtigen und möglicherweise die anschließende Zellzählung, Konzentrationsanpassung, Pipettierung und Einzelzellerfassung stören.

Ein Zellsieb bietet einen einfachen physikalischen Filtrationsschritt, der hauptsächlich auf der Partikelgröße basiert. Wenn die dissoziierte Probe das Sieb passiert, werden größere Gewebefragmente und partikuläre Materialien zurückgehalten, während einzelne Zellen und Zellpopulationen geeigneter Größe hindurchtreten. Dies trägt dazu bei, sichtbaren Debris und große strukturelle Bestandteile in der endgültigen Suspension zu reduzieren, ohne dass eine zusätzliche chemische Behandlung erforderlich ist.

Dieser Effekt kann besonders wichtig für feste Gewebeproben sein, wie Gewebebiopsien und andere komplexe biologische Proben, bei denen extrazelluläre Matrix und Bindegewebsstrukturen nach der enzymatischen Verdauung verbleiben können. Durch die Reduzierung dieser größeren Bestandteile vor der nachgelagerten Verarbeitung können Zellsiebe dazu beitragen, eine sauberere und homogenere Ausgangssuspension zu erzeugen. Dies kann die Zellzählung erleichtern, das Probenhandling verbessern und das Potenzial verringern, dass große Partikel Mikrofluidik- oder Zellerfassungssysteme stören.

Die Filtration sollte jedoch als ergänzender Schritt der Probenvorbereitung betrachtet werden und nicht als Ersatz für eine effektive Gewebedissoziation. Die Effizienz der Debrisentfernung hängt von Faktoren wie Gewebetyp, Dissoziationsmethode, Siebgröße, Probenvolumen und den physikalischen Eigenschaften des unerwünschten Materials ab. Übermäßig kleine Siebgrößen können auch den Zellverlust oder die Retention wünschenswerter Zellpopulationen erhöhen. Daher sollte die geeignete Siebporengröße entsprechend der Zielzellgröße und den Eigenschaften der Probe ausgewählt werden.

• Reduzierung von Zellaggregaten

Zellaggregation ist eine weitere große Herausforderung bei der Vorbereitung von Proben für die Einzelzellsequenzierung. Idealerweise sollte die Ausgangssuspension gut dispergierte einzelne Zellen enthalten. In der Praxis können Zellen jedoch nach der Gewebedissoziation aneinander haften bleiben und kleine oder große Aggregate bilden. Diese Aggregate können die Gleichmäßigkeit der Suspension verringern und die genaue Zellzählung, Probenbeladung und nachgelagerte Einzelzellerfassung beeinträchtigen.

Mehrere Faktoren können zur Zellaggregation beitragen, darunter unvollständige enzymatische oder mechanische Dissoziation, Zell-Zell-Adhäsion, restliche extrazelluläre Matrix, extrazelluläre DNA aus beschädigten Zellen, übermäßige Zellkonzentration und unangemessenes Probenhandling. Tote oder beschädigte Zellen können auch zelluläre Bestandteile freisetzen, die die Viskosität der Suspension erhöhen oder Wechselwirkungen zwischen Zellen fördern.

Ein richtig ausgewähltes Zellsieb kann dazu beitragen, größere Aggregate durch physikalische Größenausschluss zu reduzieren. Wenn die Zellsuspension das Sieb passiert, werden große Cluster mit höherer Wahrscheinlichkeit zurückgehalten, während einzelne Zellen und kleinere Strukturen hindurchtreten können. Dies kann die physikalische Gleichmäßigkeit der Suspension verbessern und die Anzahl großer Aggregate, die in nachgelagerte Einzelzell-Arbeitsabläufe gelangen, verringern.

Die Reduzierung von Aggregaten ist besonders relevant für Plattformen, die auf der Partitionierung oder Erfassung einzelner Zellen beruhen. Wenn zwei oder mehr Zellen in dieselbe Erfassungseinheit eingeführt werden, kann das resultierende molekulare Profil mehr als eine Zelle repräsentieren. Bei der tröpfchenbasierten Einzelzell-RNA-Sequenzierung kann beispielsweise die gleichzeitige Erfassung mehrerer Zellen zur Bildung von Doublets oder Multiplets beitragen. Diese Ereignisse können die nachgelagerte Datenanalyse erschweren und die genaue Identifizierung von Zelltypen schwieriger machen.

Zellsiebe sollten jedoch nicht als vollständige Lösung zur Doublet-Entfernung betrachtet werden. Die Effektivität der Filtration hängt stark von der Siebgröße und der Aggregatgröße ab, was bedeutet, dass kleinere Aggregate den Filter möglicherweise dennoch passieren. Darüber hinaus können sich Doublets nach der Filtration während der anschließenden Probenhandhabung, Konzentrationsanpassung, Zentrifugation oder Zellerfassungsverfahren bilden. Daher kann die Filtration die physikalische Belastung durch größere Aggregate verringern, kann Doublets jedoch nicht vollständig verhindern.

Aus diesem Grund sollte das Sieben von Zellen mit einer geeigneten Gewebedissoziation, schonendem Probenhandling, geeigneter Zellkonzentration und bei Bedarf nachgelagerter computergestützter Doublet-Erkennung kombiniert werden. Das Ziel ist nicht einfach, so viele Zellcluster wie möglich zu entfernen, sondern eine stabile Suspension zu erhalten, die einen hohen Anteil an lebensfähigen, gut dispergierten Zielzellen enthält, während unnötiger Zellverlust minimiert wird.

Wie beeinflussen Zellsiebe die Erfolgsrate der Einzelzellsequenzierung?

Der Einfluss von Zellsieben auf die Einzelzellsequenzierung ist hauptsächlich indirekt. Ein Zellsieb verbessert nicht direkt die Sequenzierungschemie, die Bibliotheksamplifikation oder die Sequenzierungsgenauigkeit. Stattdessen besteht seine primäre Funktion darin, die physikalische Qualität der Zellsuspension vor der Einzelzellerfassung zu verbessern. Für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) und andere Einzelzell-Sequenzierungsabläufe ist die Qualität der Ausgangssuspension entscheidend. Idealerweise sollte die Probe gesunde, intakte, gut dispergierte einzelne Zellen enthalten, mit minimalem Gewebedebris, extrazellulären Matrixfragmenten und großen Zellaggregaten.

Ein geeignetes Zellsieb kann größere unerwünschte Partikel und Aggregate entfernen, während einzelne Zellen und kleinere Bestandteile hindurchtreten können. Dies kann die Suspension homogener und einfacher zu verarbeiten machen während der Zellzählung, Konzentrationsanpassung und Einzelzellerfassung.

Die Beziehung kann wie folgt zusammengefasst werden: Geeignetes Zellsieb → Sauberere und gleichmäßigere Zellsuspension → Verbesserte Singlet-Qualität und reduzierte große Aggregate →
Konsistentere Zellerfassung → Zuverlässigere Bibliotheksvorbereitung →
Verbesserte Datenqualität und Interpretierbarkeit.

Es ist jedoch wichtig zu verstehen, dass ein Zellsieb nur ein Faktor ist, der die Leistung der Einzelzellsequenzierung beeinflusst. Gewebedissoziationsbedingungen, Zelllebensfähigkeit, Zellkonzentration, Probenhandhabungszeit, Temperatur, Zentrifugation, Entfernung toter Zellen und die spezifische Einzelzellplattform können ebenfalls erhebliche Auswirkungen haben.

• Verbesserung der physikalischen Gleichmäßigkeit von Zellsuspensionen

Der erste und direkteste Effekt eines Zellsiebs ist die Verbesserung der physikalischen Gleichmäßigkeit der Zellsuspension. Nach der Gewebedissoziation enthält die Probe selten nur einzelne Zellen. Abhängig vom Gewebetyp und der Dissoziationsmethode kann die Suspension einzelne Zellen, kleine Zellcluster, große Zellaggregate, undissoziierte Gewebefragmente, extrazelluläres Matrixmaterial, Zelldebris, faseriges Material und andere partikuläre Verunreinigungen enthalten. Diese größeren Strukturen können die nachgelagerte Einzelzellverarbeitung stören, indem sie Pipettenspitzen verstopfen, die automatisierte Zellzählung beeinträchtigen, Mikrofluidiksysteme stören oder unbeabsichtigt in den Einzelzellerfassungsprozess eingeführt werden. Ein Zellsieb bietet einen einfachen physikalischen Trennungsschritt, der hauptsächlich auf der Partikelgröße basiert. Wenn die Suspension das Sieb passiert, werden größere unerwünschte Strukturen zurückgehalten, während Zellen geeigneter Größe hindurchtreten. Dies trägt dazu bei, partikuläre Verunreinigungen und große Aggregate zu reduzieren, was zu einer homogeneren Zellsuspension führt, die leichter zu pipettieren, zu zählen, zu verarbeiten und in nachgelagerte Einzelzell-Arbeitsabläufe einzuführen ist.

• Reduzierung von Zellaggregaten

Zellaggregation ist ein häufiges Problem bei der Probenvorbereitung für die Einzelzellsequenzierung. Nach der Gewebedissoziation können Zellen aufgrund unvollständiger Verdauung, unzureichender mechanischer Zerstörung, restlicher extrazellulärer Matrix oder hoher Zellkonzentration aneinander haften bleiben. Große Aggregate können die Einzelzellerfassung stören und das Risiko von Doublets erhöhen, bei denen zwei oder mehr Zellen zusammen erfasst werden und gemischte molekulare Profile erzeugen. Zellsiebe helfen, größere Aggregate zu reduzieren, indem sie übermäßig große Zellcluster zurückhalten, während einzelne Zellen geeigneter Größe hindurchtreten können. Dies verbessert die Gleichmäßigkeit und Qualität der Ausgangszellsuspension vor der nachgelagerten Einzelzellanalyse. Die Filtration kann jedoch Doublets nicht vollständig eliminieren und sollte zusammen mit geeigneter Gewebedissoziation, Probenhandhabung und nachgelagerter Doublet-Erkennung verwendet werden.

• Beeinflussung der Einzelzellerfassung

Die Qualität der Ausgangszellsuspension kann die Konsistenz der Einzelzellerfassung beeinflussen. Einzelzell-Sequenzierungsplattformen erfordern im Allgemeinen, dass Zellen gut dispergiert und innerhalb eines geeigneten Konzentrationsbereichs vorliegen. Wenn die Suspension große Zellaggregate, Gewebefragmente oder übermäßigen Debris enthält, können diese Materialien die Zellzählung, Probenbeladung und nachgelagerte Erfassungsprozesse stören. Ein Zellsieb hilft, größere Partikel und Aggregate zu entfernen, während einzelne Zellen hindurchtreten können, was zu einer saubereren und gleichmäßigeren Suspension führt. Dies kann die Zellzählung und Konzentrationsanpassung verbessern und potenzielle Störungen während Mikrofluidik- oder Einzelzellerfassungsprozessen reduzieren. Daher kann eine ordnungsgemäße Filtration dazu beitragen, die Probenbeladung und Einzelzellerfassung konsistenter und vorhersehbarer zu machen.

• Unterstützung einer besseren Bibliotheksvorbereitung

Zellsiebe verbessern nicht direkt die Bibliotheksvorbereitung, können den Prozess jedoch unterstützen, indem sie die Qualität der Ausgangszellsuspension verbessern. Die Entfernung großer Zellaggregate, Gewebefragmente und Debris kann dazu beitragen, einen konsistenteren Zelleinsatz, eine vorhersehbarere Zellerfassung und sauberere Proben für die nachgelagerte Verarbeitung zu gewährleisten. Dies kann zu einer konsistenteren Bibliotheksvorbereitung und einer besseren Repräsentation einzelner Zellen beitragen. Die Bibliotheksqualität hängt jedoch auch von Faktoren wie Zelllebensfähigkeit, RNA-Integrität, Probenhandhabung, reverser Transkription, Amplifikation und Sequenzierungsbedingungen ab. Daher sollten Zellsiebe als vorgelagertes Probenvorbereitungswerkzeug betrachtet werden und nicht als direkter Faktor in der Bibliotheksvorbereitungschemie.

• Beeinflussung der Datenqualität und Interpretierbarkeit

Die Filtration verbessert nicht direkt die Sequenzierungsdaten, kann jedoch eine bessere Datenqualität unterstützen, indem sie die Ausgangszellsuspension verbessert. Die Entfernung großer Zellaggregate, Gewebefragmente und Debris kann potenzielle technische Störungen reduzieren, die Identifizierung einzelner Zellen verbessern und eine zuverlässigere Qualitätskontrolle unterstützen. Bei der scRNA-seq kann eine sauberere Suspension auch die Auswirkungen von Aggregaten und anderen Artefakten der Probenvorbereitung verringern, wodurch die Identifizierung von Zelltypen und die biologische Interpretation zuverlässiger werden. Die Filtration allein kann jedoch keine qualitativ hochwertigen Daten garantieren, da die Sequenzierungsqualität auch von der Gewebedissoziation, der Zelllebensfähigkeit, der Bibliotheksvorbereitung, der Sequenzierungstiefe und der bioinformatischen Qualitätskontrolle abhängt.

Zusammenfassung 

Zellsiebe spielen eine wichtige unterstützende Rolle bei der Einzelzell-Probenvorbereitung, indem sie große Gewebefragmente und Zellaggregate entfernen und dazu beitragen, eine sauberere und gleichmäßigere Zellsuspension für die nachgelagerte Verarbeitung zu erzeugen. Obwohl sie den Erfolg der Einzelzellsequenzierung nicht unabhängig bestimmen können, können eine geeignete Siebauswahl und schonende Filtration die Probenkonsistenz verbessern und unnötigen Zellverlust reduzieren. Letztendlich ist das Ziel nicht maximale Filtration, sondern eine qualitativ hochwertige, lebensfähige und gut dispergierte Einzelzellsuspension zu erhalten, die eine zuverlässige Grundlage für Einzelzellerfassung, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung bietet.