细胞筛网如何影响单细胞测序的成功率？

单细胞测序使研究人员能够在单个细胞水平上研究细胞异质性和分子特征。起始单细胞悬液的质量至关重要，因为组织解离可能产生细胞聚集体、组织碎片和细胞碎片。细胞筛网有助于去除这些不需要的成分，产生更干净、更均匀的细胞悬液，从而为细胞计数、单细胞捕获和下游测序提供更好的起始样本。.

什么是细胞筛网？

A 细胞筛网 细胞筛网是一种实验室耗材，设计用于将单个细胞与生物样本中的较大颗粒、组织碎片、细胞聚集体及其他不需要的颗粒物质分离开来。它通常由支撑框架和具有规定标称孔径的多孔筛网或膜组成。细胞筛网主要进行基于物理尺寸的过滤。当细胞悬液通过筛网时，液体和尺寸合适的细胞可以通过孔隙，而较大的组织碎片、细胞团块和颗粒物质则被截留。.

细胞筛网在从组织或其他复杂生物样本制备单细胞悬液过程中尤为有用。组织解离，无论是机械法还是酶解法，很少能产生完全均匀的悬液。相反，所得样本可能包含单个细胞以及细胞聚集体、未完全解离的组织、细胞外基质成分、死细胞碎片和其他颗粒。通过去除较大的不需要物质，细胞筛网有助于产生更均匀的悬液，用于后续的细胞计数、活力评估、细胞分选、流式细胞术、单细胞分析或测序。.

细胞筛网的常见应用

细胞筛网广泛用于：

组织解离
原代细胞分离
细胞培养
流式细胞术样本制备
免疫学研究
干细胞研究
类器官处理
细胞分选
单细胞测序样本制备

筛网的具体作用取决于应用场景。例如，在组织解离中，主要目的可能是去除未消化的组织碎片和细胞聚集体。在流式细胞术中，过滤有助于减少可能干扰样本加载或仪器运行的大颗粒。在单细胞测序中，过滤通常作为上游样本制备步骤，以获得分散性较好的细胞悬液。.

细胞筛网的结构

大多数细胞筛网由两个基本组件组成：支撑框架和多孔筛网。.

支撑框架提供机械稳定性，使筛网能够放置在离心管、培养容器、收集管或其他容器上方。根据产品设计，框架可由实验室兼容的聚合物（如聚丙烯，PP）制成。.

多孔筛网是功能性过滤组件。它包含规则分布的开口，具有规定的标称孔径。筛网截留无法通过开口的颗粒，同时允许液体和尺寸合适的细胞通过。.

根据设计不同，细胞筛网可提供以下形式：

管口式细胞筛网，直接适配于离心管或收集管
独立式细胞筛网，可用于培养皿、培养瓶或其他容器
离心兼容过滤装置，设计用于结合过滤和离心的操作流程
集成式过滤装置，筛网整合在更大的样本处理系统中

合适的形式取决于样本体积、操作流程设计、收集容器和下游应用。.

常见孔径

常见细胞筛网孔径包括约40 μm、70 μm和100 μm，其他孔径也可用于特殊应用。.

40 μm细胞筛网提供相对精细的过滤，适用于需要高度均匀细胞悬液的情况。然而，当样本含有大量组织碎片或细胞聚集体时，较小孔径可能更容易堵塞。.
70 μm细胞筛网作为通用选择被广泛用于许多组织解离和单细胞悬液操作流程，因为它在去除聚集体和细胞回收率之间提供了实用的平衡。.
100 μm细胞筛网具有较大孔径，适用于含有较大细胞、较大组织碎片的样本，或当较小孔径的过度过滤可能降低细胞回收率时使用。.

因此，应根据目标细胞类型、组织特性、解离效率、样本浓度和下游应用来选择最佳孔径。.

重要的是，标称孔径不应被理解为绝对的生物学截断值。细胞是否能通过筛网不仅取决于其直径，还取决于其形状、可变形性、聚集状态以及过滤过程中的物理条件。.

为什么单细胞悬液质量很重要？

单细胞测序旨在单个细胞水平上测量分子特征。要获得可靠结果，细胞必须在进入单细胞处理系统之前被充分解离、维持在适当条件下，并有效去除大的聚集体和过量碎片。.

理想的单细胞悬液应包含高比例的存活、完整且分散良好的细胞，同时尽量减少大的细胞聚集体、组织碎片和其他颗粒物质。.

起始悬液的质量可影响单细胞测序工作流程中多个重要阶段，包括：细胞计数；细胞活力评估；细胞加载；单细胞捕获；液滴生成；文库制备；测序数据质量；下游生物信息学分析。.

细胞聚集体引起的问题

分散不良的细胞悬液的主要问题之一是细胞聚集体的存在。细胞聚集体包含两个或更多在组织解离后仍保持物理关联的细胞。如果这些聚集体进入单细胞捕获系统，多个细胞可能被捕获在同一反应室中。在基于液滴的单细胞测序中，这可能导致双联体或多联体。双联体是指两个细胞被一起捕获，其分子信号随后在同一细胞分区中被检测到。多联体则涉及两个以上细胞。.

这些事件会使下游分析复杂化，因为所得基因表达谱可能包含来自多种细胞类型或细胞状态的信号。例如，一个看似代表罕见细胞群体的表达谱实际上可能是由两个不同细胞被一起捕获所致。因此，在样本制备过程中减少过度细胞聚集是获得可靠单细胞悬液的重要环节。.

组织碎片和细胞碎片的影响

除细胞聚集体外，组织解离还可产生大量细胞碎片和细胞外物质。这些物质可能包括：膜碎片；破碎的细胞组分；未消化的组织；细胞外基质材料；死细胞碎片；游离核酸。过量碎片可能干扰细胞计数和样本加载。它还可能增加样本中的背景物质，使完整细胞与非细胞颗粒更难区分。.

在某些操作流程中，受损或裂解的细胞可将细胞内RNA释放到周围溶液中。这种细胞外RNA可能形成环境RNA（ambient RNA），并可能与含有完整细胞的液滴或其他反应室相关联。环境RNA可能使基因表达解读复杂化，因为来自受损或裂解细胞的转录本可能在其他细胞分区中被检测到。因此，样本质量不仅取决于获得的细胞数量，完整细胞与碎片和聚集体的比例也很重要。.

细胞活力与样本质量

细胞活力是另一个重要参数。在组织解离和样本制备过程中，细胞可能经历机械应力、酶损伤、长时间处理、温度波动或不适当的缓冲液条件。这些因素可能增加细胞死亡并降低存活细胞的比例。.

高水平的死细胞可导致细胞碎片和游离核酸增加，进一步降低样本质量。因此，单细胞样本制备通常旨在实现以下之间的平衡：

高细胞回收率 + 高细胞活力 + 低聚集 + 低碎片

仅高总细胞数并不一定表示样本质量高。.

为什么细胞过滤有帮助

细胞筛网提供了一种相对简单的物理方法，可在下游处理之前减少较大的不需要结构。.

通过选择合适的孔径，研究人员可以截留：大的组织碎片；大的细胞聚集体；未解离的物质；其他较大的颗粒污染物。同时允许尺寸合适的细胞和周围液体通过。.

这可以改善细胞悬液的物理均匀性，并减少进入后续处理步骤的大颗粒物质数量。然而，细胞过滤只是样本制备的一个组成部分。它不能替代适当的组织解离、细胞活力控制、洗涤、浓度调整或其他必要的制备步骤。.

细胞筛网如何工作？

细胞筛网的工作原理主要基于物理过滤和尺寸依赖性分离。组织解离后，所得悬液含有不同物理尺寸的生物结构。单个细胞、细胞团块、组织碎片、细胞外物质和碎片可能共存于同一样本中。当悬液通过筛网时，筛网充当物理屏障。液体和足够小、形状合适且能够通过开口的颗粒可以穿过筛网，而较大的结构则被截留。.

基本工作流程可表示为：

解离组织 → 细胞悬液 → 细胞筛网 → 过滤后细胞悬液 → 下游分析

孔径的作用

孔径是决定过滤性能的最重要参数之一。较小孔径通常提供更精细的物理过滤，可截留较小的聚集体和颗粒。然而，较小孔径也更容易堵塞，尤其是在处理含有高浓度组织碎片或细胞聚集体的样本时。较大孔径通常提供更高的流量能力和更低的样本通过阻力。然而，较大孔径可能允许一些较大的聚集体或组织碎片通过。因此，应根据过滤的预期目的选择孔径，而不是简单地选择最小可用孔径。.

细胞通过不仅取决于直径

需要理解的是，细胞筛网并非作为绝对的分子或细胞截断装置运行。细胞通过孔隙的能力可能受到以下因素影响：细胞直径；细胞形状；细胞可变形性；细胞膜特性；聚集状态；样本粘度；过滤压力；流速；筛网结构。.

例如，在某些物理条件下，单个可变形细胞可能通过小于其静态直径的孔隙。相反，相互附着的一组细胞即使每个细胞都能单独通过同一孔隙，也可能被截留。因此，标称孔径应被理解为标准化的过滤规格，而非对将通过细胞确切尺寸的严格预测。.

过滤与细胞回收率

使用细胞筛网时最重要的考虑因素之一是颗粒去除与细胞回收率之间的平衡。如果筛网对特定样本过于精细，一些目标细胞可能连同不需要的聚集体一起被截留。这可能降低最终细胞产量。如果筛网孔径过大，则可能无法充分去除聚集体和组织碎片。因此，目标不是最大程度过滤，而是适当过滤。.

对于单细胞应用，有效的过滤步骤理想情况下应产生：相对均匀的细胞悬液；减少大的聚集体；减少组织碎片；高目标细胞回收率；最小化的额外细胞损伤。.

样本浓度的影响

样本浓度可显著影响过滤行为。高浓度悬液每单位体积含有更多细胞和颗粒。当这些物质在筛网表面积累时，可减少有效过滤面积并增加流动阻力。这可能导致过滤速度变慢和堵塞风险增加。因此，处理高浓度样本时，适当的样本制备和控制加载量有助于维持更一致的过滤性能。.

过滤压力的影响

用于推动悬液通过滤网的力也会影响结果。通常，适中且可控的流速优于过大的机械压力。过大的压力可能会提高过滤速度，但也可能增加对脆弱细胞的机械应力，并可能影响细胞完整性。因此，对于敏感的原代细胞或其他脆弱的生物样本，过滤过程应根据实验流程的要求谨慎进行。.

为什么最小孔径并非总是最佳选择

一个常见的误解是，较小的孔径会自动产生更好的单细胞悬液。实际上，过滤性能涉及以下因素之间的权衡：

聚集体去除 ↔ 细胞回收率 ↔ 过滤速度 ↔ 堵塞风险

例如，非常小的孔径可能有效去除小聚集体，但也可能导致：堵塞增加；过滤阻力增大；处理速度降低；截留部分目标细胞；整体细胞回收率降低。相反，较大的孔径可能改善流速和回收率，但可能无法充分去除较大的聚集体。因此，应根据生物样本和下游应用来确定合适的孔径。.

细胞筛如何提高单细胞悬液质量？

去除组织碎片

在组织解离过程中，原始组织结构通过机械和酶学方法被破坏以释放单个细胞。然而，完全解离并非总能实现，尤其是在处理致密或纤维化组织时。因此，所得悬液可能含有未解离的组织碎片、细胞外基质成分、结缔组织纤维和其他大颗粒物质。这些不需要的成分可能影响细胞悬液的物理质量，并可能干扰后续的细胞计数、浓度调整、移液操作和单细胞捕获。.

细胞筛提供了一种主要基于粒径的简单物理过滤步骤。当解离后的样本通过滤网时，较大的组织碎片和颗粒物质被截留，而单个细胞和大小合适的细胞群体则通过。这有助于减少最终悬液中的可见碎片和大结构成分，而无需额外的化学处理。.

这一效果对于实体组织样本尤为重要，例如组织活检样本和其他复杂的生物标本，在这些样本中，酶消化后可能仍残留细胞外基质和结缔组织结构。在下游处理之前减少这些较大成分，细胞筛有助于产生更干净、更均质的起始悬液。这可以使细胞计数更容易，改善样本处理，并降低大颗粒干扰微流控或细胞捕获系统的可能性。.

然而，过滤应被视为一种补充性的样本制备步骤，而非有效组织解离的替代方案。碎片去除效率取决于组织类型、解离方法、滤网孔径、样本体积以及不需要物质的物理特性等因素。过小的滤网孔径也可能增加细胞损失或目标细胞群体的截留。因此，应根据目标细胞大小和样本特性选择合适的筛网孔径。.

减少细胞聚集体

细胞聚集是单细胞测序样本制备过程中的另一个主要挑战。理想情况下，起始悬液应包含分散良好的单个细胞。然而，在实际操作中，组织解离后细胞可能仍相互附着，形成大小不等的聚集体。这些聚集体会降低悬液的均一性，并可能干扰准确的细胞计数、样本加载和下游单细胞捕获。.

多种因素可导致细胞聚集，包括不完全的酶学或机械解离、细胞间黏附、残留的细胞外基质、受损细胞释放的细胞外DNA、过高的细胞浓度以及不当的样本处理。死亡或受损细胞也可能释放细胞成分，增加悬液黏度或促进细胞间的相互作用。.

适当选择的细胞筛可通过物理尺寸排阻帮助减少较大的聚集体。当细胞悬液通过滤网时，大的细胞团块更可能被截留，而单个细胞和较小的结构可以通过。这可以改善悬液的物理均一性，并减少进入下游单细胞工作流程的大聚集体数量。.

减少聚集体对于依赖分区或捕获单个细胞的平台尤为重要。如果两个或多个细胞被引入同一捕获单元，所得分子谱可能代表多个细胞。例如，在基于液滴的单细胞RNA测序中，多个细胞的同时捕获可能导致双联体或多联体的形成。这些事件可能使下游数据分析复杂化，并使准确的细胞类型鉴定更加困难。.

然而，细胞筛不应被视为完全的双联体去除解决方案。过滤效果在很大程度上取决于滤网孔径和聚集体大小，这意味着较小的聚集体仍可能通过滤网。此外，双联体可能在过滤后的后续样本处理、浓度调整、离心或细胞捕获过程中形成。因此，过滤可以减少较大聚集体的物理负担，但不能完全防止双联体的产生。.

因此，细胞过滤应与适当的组织解离、温和的样本处理、合适的细胞浓度以及需要时的下游计算双联体检测相结合。目标不仅仅是尽可能多地去除细胞团块，而是获得含有高比例活存、分散良好的目标细胞的稳定悬液，同时最大限度地减少不必要的细胞损失。.

细胞筛网如何影响单细胞测序的成功率？

细胞筛对单细胞测序的影响主要是间接的。细胞筛并不直接改善测序化学、文库扩增或测序准确性。相反，其主要功能是在单细胞捕获之前改善细胞悬液的物理质量。对于单细胞RNA测序（scRNA-seq）和其他单细胞测序工作流程，起始悬液的质量至关重要。理想情况下，样本应包含健康、完整、分散良好的单个细胞，并尽量减少组织碎片、细胞外基质片段和大细胞聚集体。.

合适的细胞筛可以去除较大的不需要颗粒和聚集体，同时允许单个细胞和较小成分通过。这可以使悬液更加均质，在细胞计数、浓度调整和单细胞捕获过程中更易于处理。.

这种关系可以总结为：合适的细胞筛→更干净、更均一的细胞悬液→改善单细胞质量和减少大聚集体→
更一致的细胞捕获→更可靠的文库制备→
改善的数据质量和可解释性。.

然而，重要的是要理解，细胞筛只是影响单细胞测序性能的因素之一。组织解离条件、细胞活力、细胞浓度、样本处理时间、温度、离心、死细胞去除以及特定的单细胞平台也可能产生重大影响。.

改善细胞悬液的物理均一性

细胞筛的第一个也是最直接的效果是改善细胞悬液的物理均一性。组织解离后，样本很少只包含单个细胞。根据组织类型和解离方法的不同，悬液可能包含单个细胞、小细胞团块、大细胞聚集体、未解离的组织碎片、细胞外基质物质、细胞碎片、纤维物质和其他颗粒污染物。这些较大的结构可能通过堵塞移液管尖端、影响自动细胞计数、干扰微流控系统或无意中被引入单细胞捕获过程而干扰下游单细胞处理。细胞筛提供了一种主要基于粒径的简单物理分离步骤。当悬液通过滤网时，较大的不需要结构被截留，而大小合适的细胞通过。这有助于减少颗粒污染和大聚集体，从而产生更均质的细胞悬液，更易于移液、计数、处理并引入下游单细胞工作流程。.

减少细胞聚集体

细胞聚集是单细胞测序样本制备过程中的常见问题。组织解离后，由于消化不完全、机械破坏不足、残留细胞外基质或细胞浓度过高，细胞可能仍保持附着状态。大的聚集体可能干扰单细胞捕获，并可能增加双联体的风险，即两个或多个细胞被一起捕获并产生混合分子谱。细胞筛通过截留过大的细胞团块，同时允许大小合适的单个细胞通过，帮助减少较大的聚集体。这在下游单细胞分析之前改善了起始细胞悬液的均一性和质量。然而，过滤不能完全消除双联体，应与适当的组织解离、样本处理和下游双联体检测结合使用。.

影响单细胞捕获

起始细胞悬液的质量可能影响单细胞捕获的一致性。单细胞测序平台通常要求细胞分散良好且处于合适的浓度范围内。如果悬液含有大的细胞聚集体、组织碎片或过多碎片，这些物质可能干扰细胞计数、样本加载和下游捕获过程。细胞筛有助于去除较大的颗粒和聚集体，同时允许单个细胞通过，从而产生更干净、更均一的悬液。这可以改善细胞计数和浓度调整，并减少微流控或单细胞捕获过程中的潜在干扰。因此，适当的过滤有助于使样本加载和单细胞捕获更加一致和可预测。.

支持更好的文库制备

细胞筛并不直接改善文库制备，但可以通过改善起始细胞悬液的质量来支持该过程。去除大的细胞聚集体、组织碎片和碎片有助于提供更一致的细胞输入、更可预测的细胞捕获和更干净的样本用于下游处理。这可能有助于更一致的文库制备和更好的单个细胞代表性。然而，文库质量还取决于细胞活力、RNA完整性、样本处理、逆转录、扩增和测序条件等因素。因此，细胞筛应被视为上游样本制备工具，而非文库制备化学中的直接因素。.

影响数据质量和可解释性

过滤并不直接改善测序数据，但可以通过改善起始细胞悬液来支持更好的数据质量。去除大的细胞聚集体、组织碎片和碎片可以减少潜在的技术干扰，改善单个细胞的识别，并支持更可靠的质量控制。在scRNA-seq中，更干净的悬液还可以减少聚集体和其他样本制备伪影的影响，使细胞类型鉴定和生物学解释更加可靠。然而，仅靠过滤不能保证高质量数据，因为测序质量还取决于组织解离、细胞活力、文库制备、测序深度和生物信息学质量控制。.

总结

细胞筛在单细胞样本制备中发挥重要的支持作用，通过去除大的组织碎片和细胞聚集体，帮助产生更干净、更均一的细胞悬液用于下游处理。虽然它们不能独立决定单细胞测序的成功，但适当的筛网选择和温和的过滤可以改善样本一致性并减少不必要的细胞损失。最终目标不是最大程度地过滤，而是获得高质量、活存且分散良好的单细胞悬液，为单细胞捕获、文库制备和测序提供可靠的基础。.