細胞過濾器如何影響單細胞測序的成功率？

單細胞定序使研究人員能夠在單一細胞層級研究細胞異質性與分子特徵。起始單細胞懸浮液的品質至關重要，因為組織解離可能產生細胞團塊、組織碎片與細胞碎屑。細胞篩網有助於去除這些非預期成分，產出更乾淨、更均勻的細胞懸浮液，從而為細胞計數、單細胞捕捉及下游定序提供更佳的起始樣本。.

什麼是細胞篩網？

A 細胞篩網 細胞篩網是一種實驗室耗材，設計用於將生物樣本中的單一細胞與較大顆粒、組織碎片、細胞團塊及其他非預期顆粒物質分離。它通常由支撐框架與具有標稱孔徑的多孔篩網或薄膜組成。細胞篩網主要進行基於物理尺寸的過濾。當細胞懸浮液通過篩網時，液體與尺寸合適的細胞可通過孔洞，而較大的組織碎片、細胞團塊及顆粒物質則被攔截。.

細胞篩網在從組織或其他複雜生物樣本製備單細胞懸浮液時特別有用。組織解離，無論是機械性還是酵素性，很少能產生完全均勻的懸浮液。相反地，所得樣本可能含有單一細胞，同時伴隨細胞團塊、未完全解離的組織、細胞外基質成分、死細胞碎屑及其他顆粒。透過去除相對較大的非預期物質，細胞篩網有助於產出更均勻的懸浮液，以供後續的細胞計數、存活率評估、細胞分選、流式細胞術、單細胞分析或定序使用。.

細胞篩網的常見應用

細胞篩網廣泛應用於：

組織解離
原代細胞分離
細胞培養
流式細胞術樣本製備
免疫學研究
幹細胞研究
類器官處理
細胞分選
單細胞定序樣本製備

篩網的具體作用取決於應用場景。例如，在組織解離中，主要目的可能是去除未消化的組織碎片與細胞團塊。在流式細胞術中，過濾有助於減少可能干擾樣本上樣或儀器操作的大型顆粒。在單細胞定序中，過濾通常作為上游樣本製備步驟，以獲得相對分散良好的細胞懸浮液。.

細胞篩網的結構

大多數細胞篩網由兩個基本組件組成：支撐框架與多孔篩網。.

支撐框架提供機械穩定性，並使篩網能夠放置在離心管、培養容器、收集管或其他容器上方。依產品設計不同，框架可由實驗室相容性聚合物（如聚丙烯，PP）製成。.

多孔篩網是功能性過濾組件。它含有規則分布且具有標稱孔徑的開口。篩網攔截無法通過開口的顆粒，同時允許液體與尺寸合適的細胞通過。.

依設計不同，細胞篩網可提供為以下形式：

管口式細胞篩網，可直接安裝於離心管或收集管上
獨立式細胞篩網，可與培養皿、培養瓶或其他容器搭配使用
離心相容式過濾單元，專為結合過濾與離心的流程設計
整合式過濾裝置，篩網整合於較大的樣本處理系統中

適當的型式取決於樣本體積、流程設計、收集容器及下游應用。.

常見孔徑

常見的細胞篩網孔徑約為40 μm、70 μm及100 μm，但亦有其他孔徑可供特殊應用使用。.

40 μm細胞篩網提供相對精細的過濾，在需要高度均勻細胞懸浮液時可能適用。然而，當樣本含有大量組織碎屑或細胞團塊時，較小的孔洞可能更容易堵塞。.
70 μm細胞篩網廣泛作為許多組織解離與單細胞懸浮液流程的通用選擇，因為它在去除團塊與細胞回收之間提供了實用的平衡。.
100 μm細胞篩網具有較大的孔洞，可能適用於含有較大細胞、較大組織碎片的樣本，或當使用較小孔徑過度過濾可能降低細胞回收率的應用。.

因此，應根據目標細胞類型、組織特性、解離效率、樣本濃度及下游應用來選擇最佳孔徑。.

重要的是，標稱孔徑不應被解釋為絕對的生物學截斷值。細胞是否能通過篩網不僅取決於其直徑，還取決於其形狀、可變形性、聚集狀態及過濾過程中的物理條件。.

為什麼單細胞懸浮液品質很重要？

單細胞定序旨在於單一細胞層級測量分子特徵。為獲得可靠的結果，細胞必須在進入單細胞處理系統之前充分解離、維持在適當條件下，並有效與大型團塊及過量碎屑分離。.

理想的單細胞懸浮液應含有高比例的存活、完整且分散良好的細胞，同時盡量減少大型細胞團塊、組織碎片及其他顆粒物質。.

起始懸浮液的品質可能影響單細胞定序流程的多個重要階段，包括：細胞計數；細胞存活率評估；細胞上樣；單細胞捕捉；液滴生成；文庫製備；定序資料品質；下游生物資訊分析。.

細胞團塊引起的問題

分散不良的細胞懸浮液主要關注點之一是細胞團塊的存在。細胞團塊包含兩個或更多在組織解離後仍保持物理結合的細胞。如果這些團塊進入單細胞捕捉系統，多個細胞可能被捕捉到同一反應區間中。在基於液滴的單細胞定序中，這可能導致雙聯體或多聯體的產生。雙聯體是指兩個細胞被共同捕捉，其分子訊號隨後在同一細胞分割區間中被偵測到。多聯體則涉及兩個以上的細胞。.

這些事件可能使下游分析複雜化，因為所得到的基因表現譜可能包含來自多種細胞類型或細胞狀態的訊號。例如，一個看似代表罕見細胞群體的表現譜，實際上可能源於兩個不同細胞被共同捕捉。因此，在樣本製備過程中減少過度的細胞聚集是獲得可靠單細胞懸浮液的重要環節。.

組織碎片與細胞碎屑的影響

除了細胞團塊之外，組織解離還可能產生大量細胞碎屑與細胞外物質。這些物質可能包括：膜碎片；破裂的細胞組件；未消化的組織；細胞外基質物質；死細胞碎屑；游離核酸。過量的碎屑可能干擾細胞計數與樣本上樣。它還可能增加樣本內的背景物質，使完整細胞與非細胞顆粒更難區分。.

在某些流程中，受損或裂解的細胞可能將細胞內RNA釋放到周圍溶液中。這種細胞外RNA可能導致環境RNA（ambient RNA）的產生，進而可能附著於含有完整細胞的液滴或其他反應區間。環境RNA可能使基因表現的解釋複雜化，因為來自受損或裂解細胞的轉錄本可能在其他細胞分割區間中被偵測到。因此，樣本品質不僅取決於獲得的細胞數量。完整細胞與碎屑及團塊之間的比例同樣重要。.

細胞存活率與樣本品質

細胞存活率是另一個重要參數。在組織解離與樣本製備過程中，細胞可能經歷機械應力、酵素損傷、長時間處理、溫度波動或不適當的緩衝液條件。這些因素可能增加細胞死亡並降低存活細胞的比例。.

高比例的死亡細胞可能導致細胞碎屑與游離核酸增加，進一步降低樣本品質。因此，單細胞樣本製備通常旨在達成以下之間的平衡：

高細胞回收率 + 高細胞存活率 + 低聚集率 + 低碎屑量

僅有高總細胞數並不一定代表高品質樣本。.

為什麼細胞篩濾有幫助

細胞篩網提供了一種相對簡單的物理方法，可在下游處理之前去除較大的非預期結構。.

透過選擇適當的孔徑，研究人員可以攔截：大型組織碎片；大型細胞團塊；未解離物質；其他相對較大的顆粒污染物。同時允許尺寸合適的細胞及周圍液體通過。.

這可以改善細胞懸浮液的物理均勻性，並減少進入後續處理步驟的大型顆粒物質數量。然而，細胞篩濾僅是樣本製備的一個環節。它無法取代適當的組織解離、細胞存活率控制、清洗、濃度調整或其他必要的製備步驟。.

細胞篩網如何運作？

細胞篩網的工作原理主要基於物理過濾與尺寸依賴性分離。組織解離後，所得懸浮液含有不同物理尺寸的生物結構。單一細胞、細胞團塊、組織碎片、細胞外物質與碎屑可能共存於同一樣本中。當懸浮液通過篩網時，篩網作為物理屏障。液體及足夠小、形狀適當且能通過開口的顆粒可穿過篩網，而較大的結構則被攔截。.

基本流程可表示為：

解離組織 → 細胞懸浮液 → 細胞篩網 → 過濾後細胞懸浮液 → 下游分析

孔徑的作用

孔徑是決定過濾性能最重要的參數之一。較小的孔徑通常提供更精細的物理過濾，可攔截較小的團塊與顆粒。然而，較小的孔洞也更容易堵塞，特別是在處理含有高濃度組織碎屑或細胞團塊的樣本時。較大的孔徑通常提供更高的流量能力與較低的樣本通過阻力。然而，較大的孔洞可能允許一些較大的團塊或組織碎片通過。因此，應根據過濾的預期目的來選擇孔徑，而非單純選擇最小的可用孔徑。.

細胞通過並非僅由直徑決定

重要的是要理解，細胞篩網並非作為絕對的分子或細胞截斷裝置運作。細胞通過孔洞的能力可能受到以下因素影響：細胞直徑；細胞形狀；細胞可變形性；細胞膜特性；聚集狀態；樣本黏度；過濾壓力；流速；篩網結構。.

例如，一個具有可變形性的單一細胞在某些物理條件下可能通過小於其靜態直徑的孔洞。相反地，一組彼此附著的細胞即使每個單一細胞都能通過相同孔洞，也可能被攔截。因此，標稱孔徑應被理解為標準化的過濾規格，而非對每個將通過細胞之確切尺寸的嚴格預測。.

過濾與細胞回收

使用細胞篩網時最重要的考量之一是在顆粒去除與細胞回收之間取得平衡。如果篩網對特定樣本而言過於精細，一些目標細胞可能與非預期團塊一起被攔截。這可能降低最終細胞產量。如果篩網孔徑過大，則可能發生團塊與組織碎片去除不足的情況。因此，目標並非最大程度過濾，而是適當過濾。.

對於單細胞應用，有效的過濾步驟理想上應產出：相對均勻的細胞懸浮液；減少大型團塊；減少組織碎屑；高目標細胞回收率；最小化的額外細胞損傷。.

樣本濃度的影響

樣本濃度可能顯著影響過濾行為。高濃度懸浮液在單位體積中含有更多細胞與顆粒。當這些物質在篩網表面累積時，可能減少有效過濾面積並增加流動阻力。這可能導致過濾速度變慢並增加堵塞風險。因此，在處理濃縮樣本時，適當的樣本製備與控制上樣量有助於維持更一致的過濾性能。.

過濾壓力的影響

用於推動懸浮液通過篩網的力也會影響結果。相較於過度的機械壓力，溫和且受控的流動通常是更理想的選擇。過大的壓力可能會提高過濾速度，但也可能增加對脆弱細胞的機械應力，並潛在影響細胞完整性。因此，對於敏感的原代細胞或其他脆弱的生物樣本，過濾過程應根據實驗流程的要求謹慎進行。.

為何最小孔徑並非總是最佳選擇

一個常見的誤解是，較小的孔徑必然會產生更好的單細胞懸浮液。實際上，過濾性能涉及以下因素之間的權衡：

聚集體去除 ↔ 細胞回收率 ↔ 過濾速度 ↔ 堵塞風險

例如，非常小的孔徑可能有效去除小聚集體，但也可能：增加堵塞；增加過濾阻力；降低處理速度；滯留部分目標細胞；降低整體細胞回收率。相反地，較大的孔徑可能改善流速和回收率，但可能無法去除足夠大的聚集體。因此，應根據生物樣本和下遊應用來確定合適的孔徑。.

細胞過濾器如何提升單細胞懸浮液品質？

去除組織碎片

在組織解離過程中，原始組織結構通過機械和酶解方式被破壞以釋放單個細胞。然而，完全解離並非總是可能實現，尤其是在處理緻密或纖維性組織時。因此，所得懸浮液可能含有未解離的組織碎片、細胞外基質成分、結締組織纖維及其他大型顆粒物質。這些不需要的成分會影響細胞懸浮液的物理品質，並可能干擾後續的細胞計數、濃度調整、移液操作及單細胞捕獲。.

細胞過濾器提供了一個主要基於顆粒大小的簡單物理過濾步驟。當解離後的樣本通過篩網時，較大的組織碎片和顆粒物質被截留，而單個細胞和大小合適的細胞群則通過。這有助於減少最終懸浮液中的可見碎片和大型結構成分，而無需額外的化學處理。.

這一效果對於固體組織樣本尤為重要，例如組織活檢和其他複雜的生物標本，在酶消化後可能殘留細胞外基質和結締組織結構。在下遊處理前減少這些較大的成分，細胞過濾器有助於產生更乾淨、更均勻的起始懸浮液。這可使細胞計數更為容易，改善樣本處理，並減少大顆粒干擾微流體或細胞捕獲系統的可能性。.

然而，過濾應被視為輔助性的樣本製備步驟，而非有效組織解離的替代方案。碎片去除的效率取決於組織類型、解離方法、篩網孔徑、樣本體積以及不需要物質的物理特性等因素。過小的篩網孔徑也可能增加細胞損失或目標細胞群的滯留。因此，應根據目標細胞大小和樣本特性選擇合適的過濾器孔徑。.

減少細胞聚集體

細胞聚集是單細胞測序樣本製備過程中的另一個主要挑戰。理想情況下，起始懸浮液應含有充分分散的單個細胞。然而，在實踐中，組織解離後細胞可能仍相互黏附，形成大小不一的聚集體。這些聚集體會降低懸浮液的均勻性，並可能干擾準確的細胞計數、樣本上樣及下遊單細胞捕獲。.

多種因素可能導致細胞聚集，包括不完全的酶解或機械解離、細胞間黏附、殘留的細胞外基質、受損細胞釋放的細胞外DNA、過高的細胞濃度以及不當的樣本處理。死亡或受損細胞也可能釋放細胞成分，增加懸浮液的黏度或促進細胞間的相互作用。.

適當選擇的細胞過濾器可通過物理尺寸排除效應幫助減少較大的聚集體。當細胞懸浮液通過篩網時，大型細胞團更有可能被截留，而單個細胞和較小的結構則可通過。這可改善懸浮液的物理均勻性，並減少進入下遊單細胞工作流程的大型聚集體數量。.

減少聚集體對於依賴分配或捕獲單個細胞的平台尤為重要。如果兩個或多個細胞被引入同一個捕獲單元，所得的分子譜可能代表多於一個細胞。例如，在基於液滴的單細胞RNA測序中，多個細胞的同時捕獲可能導致雙聯體或多聯體的形成。這些事件可能使下遊數據分析複雜化，並使準確的細胞類型鑑定更加困難。.

然而，細胞過濾器不應被視為完整的雙聯體去除解決方案。過濾的有效性在很大程度上取決於篩網孔徑和聚集體大小，這意味著較小的聚集體仍可能通過過濾器。此外，雙聯體可能在過濾後的後續樣本處理、濃度調整、離心或細胞捕獲過程中形成。因此，過濾可以減少較大聚集體的物理負擔，但無法完全防止雙聯體的產生。.

因此，細胞過濾應與適當的組織解離、溫和的樣本處理、合適的細胞濃度以及必要時的下遊計算雙聯體檢測相結合。目標並非簡單地盡可能多地去除細胞團塊，而是獲得含有高比例存活、良好分散的目標細胞的穩定懸浮液，同時盡量減少不必要的細胞損失。.

細胞過濾器如何影響單細胞測序的成功率？

細胞過濾器對單細胞測序的影響主要是間接的。細胞過濾器並不直接改善測序化學反應、文庫擴增或測序準確性。相反，其主要功能是在單細胞捕獲前改善細胞懸浮液的物理品質。對於單細胞RNA測序（scRNA-seq）及其他單細胞測序工作流程，起始懸浮液的品質至關重要。理想情況下，樣本應含有健康、完整、良好分散的單個細胞，並盡量減少組織碎片、細胞外基質片段和大型細胞聚集體。.

合適的細胞過濾器可以去除較大的不需要顆粒和聚集體，同時允許單個細胞和較小的成分通過。這可使懸浮液更加均勻，在細胞計數、濃度調整和單細胞捕獲過程中更易於處理。.

這一關係可總結為：合適的細胞過濾器→更乾淨、更均勻的細胞懸浮液→改善的單細胞品質和減少的較大聚集體→
更一致的細胞捕獲→更可靠的文庫製備→
改善的數據品質和可解釋性。.

然而，重要的是要理解，細胞過濾器只是影響單細胞測序性能的因素之一。組織解離條件、細胞活力、細胞濃度、樣本處理時間、溫度、離心、死細胞去除以及特定的單細胞平台也可能產生重大影響。.

改善細胞懸浮液的物理均勻性

細胞過濾器的第一個也是最直接的效果是改善細胞懸浮液的物理均勻性。組織解離後，樣本很少只含有單個細胞。根據組織類型和解離方法，懸浮液可能含有單個細胞、小細胞團、大型細胞聚集體、未解離的組織碎片、細胞外基質材料、細胞碎片、纖維物質及其他顆粒污染物。這些較大的結構可能通過堵塞移液管尖端、影響自動化細胞計數、干擾微流體系統或無意中被引入單細胞捕獲過程而干擾下遊單細胞處理。細胞過濾器提供了一個主要基於顆粒大小的簡單物理分離步驟。當懸浮液通過篩網時，較大的不需要結構被截留，而大小合適的細胞則通過。這有助於減少顆粒污染和大型聚集體，產生更均勻的細胞懸浮液，更易於移液、計數、處理並引入下遊單細胞工作流程。.

減少細胞聚集體

細胞聚集是單細胞測序樣本製備過程中的常見問題。組織解離後，由於消化不完全、機械破壞不足、殘留的細胞外基質或高細胞濃度，細胞可能保持黏附狀態。大型聚集體可能干擾單細胞捕獲，並可能增加雙聯體的風險，即兩個或多個細胞被一起捕獲並產生混合的分子譜。細胞過濾器通過截留過大的細胞團，同時允許大小合適的單個細胞通過，幫助減少較大的聚集體。這在下遊單細胞分析前改善了起始細胞懸浮液的均勻性和品質。然而，過濾無法完全消除雙聯體，應與適當的組織解離、樣本處理及下遊雙聯體檢測結合使用。.

影響單細胞捕獲

起始細胞懸浮液的品質可能影響單細胞捕獲的一致性。單細胞測序平台通常要求細胞充分分散且在合適的濃度範圍內。如果懸浮液含有大型細胞聚集體、組織碎片或過多的碎片，這些物質可能干擾細胞計數、樣本上樣及下遊捕獲過程。細胞過濾器有助於去除較大的顆粒和聚集體，同時允許單個細胞通過，產生更乾淨、更均勻的懸浮液。這可改善細胞計數和濃度調整，並減少微流體或單細胞捕獲過程中的潛在干擾。因此，適當的過濾有助於使樣本上樣和單細胞捕獲更加一致和可預測。.

支持更好的文庫製備

細胞過濾器並不直接改善文庫製備，但可通過改善起始細胞懸浮液的品質來支持該過程。去除大型細胞聚集體、組織碎片和碎屑有助於提供更一致的細胞輸入、更可預測的細胞捕獲以及更乾淨的樣本供下遊處理。這可能有助於更一致的文庫製備和更好的單個細胞代表性。然而，文庫品質還取決於細胞活力、RNA完整性、樣本處理、逆轉錄、擴增和測序條件等因素。因此，細胞過濾器應被視為上游樣本製備工具，而非文庫製備化學的直接因素。.

影響數據品質和可解釋性

過濾並不直接改善測序數據，但可通過改善起始細胞懸浮液來支持更好的數據品質。去除大型細胞聚集體、組織碎片和碎屑可減少潛在的技術干擾，改善單個細胞的識別，並支持更可靠的品質控制。在scRNA-seq中，更乾淨的懸浮液也可能減少聚集體和其他樣本製備偽影的影響，使細胞類型鑑定和生物學解釋更加可靠。然而，僅靠過濾無法保證高品質的數據，因為測序品質還取決於組織解離、細胞活力、文庫製備、測序深度和生物信息學品質控制。.

摘要

細胞過濾器在單細胞樣本製備中扮演重要的輔助角色，通過去除大型組織碎片和細胞聚集體，有助於為下遊處理產生更乾淨、更均勻的細胞懸浮液。雖然它們無法獨立決定單細胞測序的成功與否，但適當的過濾器選擇和溫和的過濾操作可改善樣本一致性並減少不必要的細胞損失。最終，目標並非最大程度的過濾，而是獲得高品質、存活且良好分散的單細胞懸浮液，為單細胞捕獲、文庫製備和測序提供可靠的基礎。.