Comment les tamis à cellules influencent-ils le taux de réussite du séquençage monocellulaire ?

Le séquençage unicellulaire permet aux chercheurs d'étudier l'hétérogénéité cellulaire et les caractéristiques moléculaires au niveau de la cellule individuelle. La qualité de la suspension cellulaire initiale est critique, car la dissociation tissulaire peut générer des agrégats cellulaires, des fragments tissulaires et des débris cellulaires. Les filtres cellulaires aident à éliminer ces composants indésirables et à produire une suspension cellulaire plus propre et plus uniforme, offrant ainsi un meilleur échantillon de départ pour le comptage cellulaire, la capture unicellulaire et le séquençage en aval.

Qu'est-ce qu'un filtre cellulaire ?

Un tamis cellulaire Il s'agit d'un consommable de laboratoire conçu pour séparer les cellules individuelles des particules plus grandes, des fragments tissulaires, des agrégats cellulaires et d'autres matières particulaires indésirables présents dans un échantillon biologique. Il se compose généralement d'un cadre de support et d'un maillage ou d'une membrane poreuse avec une taille de pores nominale définie. Les filtres cellulaires assurent principalement une filtration physique basée sur la taille. Lorsqu'une suspension cellulaire traverse le maillage, le liquide et les cellules de taille appropriée peuvent passer à travers les pores, tandis que les fragments tissulaires plus grands, les amas cellulaires et les matières particulaires sont retenus.

Les filtres cellulaires sont particulièrement utiles lors de la préparation de suspensions unicellulaires à partir de tissus ou d'autres échantillons biologiques complexes. La dissociation tissulaire, qu'elle soit mécanique ou enzymatique, produit rarement une suspension complètement uniforme. Au lieu de cela, l'échantillon résultant peut contenir des cellules individuelles ainsi que des agrégats cellulaires, des tissus incomplètement dissociés, des composants de la matrice extracellulaire, des débris de cellules mortes et d'autres particules. En éliminant les matières indésirables relativement grandes, un filtre cellulaire peut contribuer à produire une suspension plus uniforme pour le comptage cellulaire, l'évaluation de la viabilité, le tri cellulaire, la cytométrie en flux, l'analyse unicellulaire ou le séquençage ultérieurs.

Applications courantes des filtres cellulaires

Les filtres cellulaires sont largement utilisés dans :

• La dissociation tissulaire
• L'isolement de cellules primaires
• Culture cellulaire
• La préparation d'échantillons pour la cytométrie en flux
• La recherche en immunologie
• Recherche sur les cellules souches
• Le traitement des organoïdes
• Le tri cellulaire
• La préparation d'échantillons pour le séquençage unicellulaire

Le rôle spécifique du filtre dépend de l'application. Par exemple, lors de la dissociation tissulaire, l'objectif principal peut être d'éliminer les fragments tissulaires non digérés et les agrégats cellulaires. En cytométrie en flux, la filtration peut contribuer à réduire la présence de grandes particules susceptibles d'interférer avec le chargement de l'échantillon ou le fonctionnement de l'instrument. En séquençage unicellulaire, la filtration est couramment utilisée comme étape de préparation en amont pour obtenir une suspension cellulaire relativement bien dispersée.

Structure d'un filtre cellulaire

La plupart des filtres cellulaires se composent de deux éléments de base : un cadre de support et un maillage poreux.

Le cadre de support assure la stabilité mécanique et permet de positionner le filtre au-dessus d'un tube à centrifuger, d'un récipient de culture, d'un tube de collecte ou d'un autre contenant. Selon la conception du produit, le cadre peut être fabriqué à partir de polymères compatibles avec les laboratoires, tels que le polypropylène (PP).

Le maillage poreux est le composant fonctionnel de filtration. Il contient des ouvertures régulièrement réparties avec une taille de pores nominale définie. Le maillage retient les particules qui ne peuvent pas traverser les ouvertures tout en permettant au liquide et aux cellules de taille appropriée de passer.

Selon la conception, les filtres cellulaires peuvent être fournis sous forme de :

• Filtres cellulaires pour tube, qui s'adaptent directement sur des tubes à centrifuger ou des tubes de collecte
• Filtres cellulaires autonomes, qui peuvent être utilisés avec des boîtes, des flacons ou d'autres récipients
• Unités de filtration compatibles avec la centrifugation, conçues pour les flux de travail combinant filtration et centrifugation
• Dispositifs de filtration intégrés, dans lesquels le filtre est incorporé dans un système plus vaste de traitement des échantillons

Le format approprié dépend du volume de l'échantillon, de la conception du flux de travail, du récipient de collecte et de l'application en aval.

Tailles de pores courantes

Les tailles de pores courantes des filtres cellulaires comprennent environ 40 μm, 70 μm et 100 μm, bien que d'autres tailles de pores soient disponibles pour des applications spécialisées.

• Un filtre cellulaire de 40 μm offre une filtration relativement fine et peut convenir lorsqu'une suspension cellulaire hautement uniforme est requise. Cependant, des pores plus petits peuvent se boucher plus facilement lorsque les échantillons contiennent de grandes quantités de débris tissulaires ou d'agrégats cellulaires.
• Un filtre cellulaire de 70 μm est largement utilisé comme option polyvalente pour de nombreux flux de travail de dissociation tissulaire et de préparation de suspensions unicellulaires, car il offre un équilibre pratique entre l'élimination des agrégats et la récupération cellulaire.
• Un filtre cellulaire de 100 μm possède des pores plus grands et peut être utile pour les échantillons contenant des cellules plus grandes, des fragments tissulaires plus importants, ou pour les applications où une filtration excessive à travers des pores plus petits pourrait réduire la récupération cellulaire.

La taille de pores optimale doit donc être sélectionnée en fonction du type cellulaire cible, des caractéristiques tissulaires, de l'efficacité de dissociation, de la concentration de l'échantillon et de l'application en aval.

Il est important de noter que la taille de pores nominale ne doit pas être interprétée comme une limite biologique absolue. Le fait qu'une cellule traverse un maillage dépend non seulement de son diamètre, mais aussi de sa forme, de sa déformabilité, de son état d'agrégation et des conditions physiques pendant la filtration.

Pourquoi la qualité de la suspension unicellulaire est-elle importante ?

Le séquençage unicellulaire est conçu pour mesurer les caractéristiques moléculaires au niveau des cellules individuelles. Pour obtenir des résultats fiables, les cellules doivent être correctement dissociées, maintenues dans des conditions appropriées et efficacement séparées des grands agrégats et des débris excessifs avant d'entrer dans le système de traitement unicellulaire.

Une suspension unicellulaire idéale doit contenir une proportion élevée de cellules viables, intactes et bien dispersées, tout en minimisant les grands agrégats cellulaires, les fragments tissulaires et autres matières particulaires.

La qualité de la suspension initiale peut influencer plusieurs étapes importantes d'un flux de travail de séquençage unicellulaire, notamment : le comptage cellulaire ; l'évaluation de la viabilité cellulaire ; le chargement des cellules ; la capture unicellulaire ; la génération de gouttelettes ; la préparation de la bibliothèque ; la qualité des données de séquençage ; l'analyse bioinformatique en aval.

Problèmes causés par les agrégats cellulaires

L'une des principales préoccupations concernant une suspension cellulaire mal dispersée est la présence d'agrégats cellulaires. Un agrégat cellulaire contient deux cellules ou plus qui restent physiquement associées après la dissociation tissulaire. Si ces agrégats pénètrent dans un système de capture unicellulaire, plusieurs cellules peuvent être capturées dans le même compartiment de réaction. Dans le séquençage unicellulaire basé sur des gouttelettes, cela peut contribuer à la formation de doublets ou de multiplets. Un doublet se produit lorsque deux cellules sont capturées ensemble et que leurs signaux moléculaires sont ensuite détectés dans la même partition cellulaire. Un multiplet implique plus de deux cellules.

Ces événements peuvent compliquer l'analyse en aval, car le profil d'expression génique résultant peut contenir des signaux provenant de plusieurs types cellulaires ou états cellulaires. Par exemple, un profil qui semble représenter une population cellulaire inhabituelle peut en réalité résulter de la capture conjointe de deux cellules différentes. Par conséquent, réduire l'agrégation cellulaire excessive pendant la préparation des échantillons est une étape importante pour obtenir une suspension unicellulaire fiable.

Impact des fragments tissulaires et des débris cellulaires

En plus des agrégats cellulaires, la dissociation tissulaire peut générer de grandes quantités de débris cellulaires et de matériel extracellulaire. Ces matériaux peuvent inclure : des fragments membranaires ; des composants cellulaires brisés ; des tissus non digérés ; du matériel de matrice extracellulaire ; des débris de cellules mortes ; des acides nucléiques libres. Des débris excessifs peuvent interférer avec le comptage cellulaire et le chargement des échantillons. Ils peuvent également augmenter le matériel de fond dans l'échantillon et rendre plus difficile la distinction entre les cellules intactes et les particules non cellulaires.

Dans certains flux de travail, les cellules endommagées ou lysées peuvent libérer de l'ARN intracellulaire dans la solution environnante. Cet ARN extracellulaire peut contribuer à l'ARN ambiant, qui peut s'associer aux gouttelettes ou à d'autres compartiments de réaction contenant des cellules intactes. L'ARN ambiant peut compliquer l'interprétation de l'expression génique, car les transcrits provenant de cellules endommagées ou lysées peuvent être détectés dans d'autres partitions cellulaires. Par conséquent, la qualité de l'échantillon n'est pas déterminée uniquement par le nombre de cellules obtenues. Le rapport entre les cellules intactes et les débris et agrégats est également important.

Viabilité cellulaire et qualité de l'échantillon

La viabilité cellulaire est un autre paramètre important. Pendant la dissociation tissulaire et la préparation des échantillons, les cellules peuvent subir un stress mécanique, des dommages enzymatiques, un traitement prolongé, des fluctuations de température ou des conditions de tampon inappropriées. Ces facteurs peuvent augmenter la mort cellulaire et réduire la proportion de cellules viables.

Un niveau élevé de cellules mortes peut entraîner une augmentation des débris cellulaires et des acides nucléiques libres, réduisant encore la qualité de l'échantillon. Pour cette raison, la préparation d'échantillons unicellulaires vise généralement à atteindre un équilibre entre :

Récupération cellulaire élevée + viabilité cellulaire élevée + faible agrégation + faible quantité de débris

Un nombre total de cellules élevé ne signifie pas nécessairement que l'échantillon est de haute qualité.

Pourquoi la filtration cellulaire est utile

Les filtres cellulaires offrent une méthode physique relativement simple pour réduire les structures indésirables plus grandes avant le traitement en aval.

En sélectionnant une taille de pores appropriée, les chercheurs peuvent retenir : les grands fragments tissulaires ; les grands agrégats cellulaires ; le matériel non dissocié ; d'autres contaminants particulaires relativement grands. Tout en permettant aux cellules de taille appropriée et au liquide environnant de passer.

Cela peut améliorer l'uniformité physique de la suspension cellulaire et réduire la quantité de grandes matières particulaires entrant dans les étapes de traitement ultérieures. Cependant, la filtration cellulaire n'est qu'un composant de la préparation des échantillons. Elle ne peut pas remplacer une dissociation tissulaire appropriée, le contrôle de la viabilité cellulaire, le lavage, l'ajustement de la concentration ou d'autres étapes de préparation nécessaires.

Comment fonctionnent les filtres cellulaires ?

Le principe de fonctionnement d'un filtre cellulaire repose principalement sur la filtration physique et la séparation dépendante de la taille. Après la dissociation tissulaire, la suspension résultante contient des structures biologiques de différentes dimensions physiques. Les cellules individuelles, les amas cellulaires, les fragments tissulaires, le matériel extracellulaire et les débris peuvent coexister dans le même échantillon. Lorsque la suspension traverse le filtre, le maillage agit comme une barrière physique. Le liquide et les particules suffisamment petites, de forme appropriée et capables de traverser les ouvertures peuvent passer à travers le maillage, tandis que les structures plus grandes sont retenues.

Le flux de travail de base peut être représenté comme suit :

Tissu dissocié → Suspension cellulaire → Filtre cellulaire → Suspension cellulaire filtrée → Analyse en aval

• Le rôle de la taille des pores

La taille des pores est l'un des paramètres les plus importants déterminant les performances de filtration. Une taille de pores plus petite offre généralement une filtration physique plus fine et peut retenir des agrégats et des particules plus petits. Cependant, les pores plus petits ont également une plus grande tendance à se boucher, en particulier lors du traitement d'échantillons avec des concentrations élevées de débris tissulaires ou d'agrégats cellulaires. Une taille de pores plus grande offre généralement une capacité de débit plus élevée et une résistance plus faible au passage de l'échantillon. Cependant, des pores plus grands peuvent permettre à certains agrégats ou fragments tissulaires plus grands de passer. Par conséquent, la taille des pores doit être sélectionnée en fonction de l'objectif prévu de la filtration, plutôt que de simplement choisir la plus petite taille de pores disponible.

• Le passage des cellules n'est pas déterminé uniquement par le diamètre

Il est important de comprendre qu'un filtre cellulaire ne fonctionne pas comme une limite absolue moléculaire ou cellulaire. La capacité d'une cellule à traverser un pore peut être affectée par : le diamètre cellulaire ; la forme cellulaire ; la déformabilité cellulaire ; les propriétés de la membrane cellulaire ; l'état d'agrégation ; la viscosité de l'échantillon ; la pression de filtration ; le débit ; la structure du maillage.

Par exemple, une cellule individuelle déformable peut traverser un pore plus petit que son diamètre statique dans certaines conditions physiques. En revanche, un groupe de cellules attachées les unes aux autres peut être retenu même si chaque cellule individuelle pourrait traverser le même pore. Par conséquent, la taille de pores nominale doit être interprétée comme une spécification de filtration standardisée, et non comme une prédiction stricte de la taille exacte de chaque cellule qui traversera.

• Filtration et récupération cellulaire

L'une des considérations les plus importantes lors de l'utilisation d'un filtre cellulaire est l'équilibre entre l'élimination des particules et la récupération cellulaire. Si le maillage est trop fin pour un échantillon particulier, certaines cellules cibles peuvent être retenues avec les agrégats indésirables. Cela peut réduire le rendement cellulaire final. Si le maillage est trop grand, une élimination insuffisante des agrégats et des fragments tissulaires peut se produire. L'objectif n'est donc pas une filtration maximale, mais une filtration appropriée.

Pour les applications unicellulaires, une étape de filtration efficace devrait idéalement produire : une suspension cellulaire relativement uniforme ; une réduction des grands agrégats ; une réduction des débris tissulaires ; une récupération élevée des cellules cibles ; des dommages cellulaires supplémentaires minimaux.

• Effet de la concentration de l'échantillon

La concentration de l'échantillon peut affecter de manière significative le comportement de filtration. Les suspensions hautement concentrées contiennent plus de cellules et de particules par unité de volume. Lorsque ces matériaux s'accumulent à la surface du maillage, ils peuvent réduire la surface de filtration effective et augmenter la résistance au flux. Cela peut entraîner une filtration plus lente et un risque plus élevé de colmatage. Par conséquent, lors du travail avec des échantillons concentrés, une préparation appropriée de l'échantillon et un chargement contrôlé peuvent contribuer à maintenir des performances de filtration plus cohérentes.

• Effet de la pression de filtration

La force utilisée pour pousser la suspension à travers le maillage peut également influencer le résultat. Un débit modéré et contrôlé est généralement préférable à une pression mécanique excessive. Une pression excessive peut augmenter la vitesse de filtration, mais elle peut également accroître le stress mécanique sur les cellules fragiles et potentiellement affecter l'intégrité cellulaire. Pour les cellules primaires sensibles ou d'autres échantillons biologiques fragiles, le processus de filtration doit donc être réalisé avec soin et conformément aux exigences du flux de travail expérimental.

• Pourquoi la plus petite taille de pores n'est pas toujours le meilleur choix

Une idée reçue courante est qu'une plus petite taille de pores produira automatiquement une meilleure suspension de cellules uniques. En réalité, la performance de filtration implique un compromis entre :

Élimination des agrégats ↔ Récupération cellulaire ↔ Vitesse de filtration ↔ Risque de colmatage

Par exemple, une très petite taille de pores peut éliminer efficacement les petits agrégats mais peut également : augmenter le colmatage ; augmenter la résistance à la filtration ; réduire la vitesse de traitement ; retenir certaines cellules souhaitées ; réduire la récupération cellulaire globale. À l'inverse, une taille de pores plus grande peut améliorer le débit et la récupération mais peut ne pas éliminer les agrégats suffisamment volumineux. La taille de pores appropriée doit donc être déterminée en fonction de l'échantillon biologique et de l'application en aval.

Comment les filtres cellulaires améliorent-ils la qualité de la suspension de cellules uniques ?

• Élimination des débris tissulaires

Au cours de la dissociation tissulaire, la structure tissulaire d'origine est perturbée mécaniquement et enzymatiquement pour libérer les cellules individuelles. Cependant, une dissociation complète n'est pas toujours possible, en particulier lors du travail avec des tissus denses ou fibreux. La suspension résultante peut donc contenir des fragments tissulaires non dissociés, des composants de la matrice extracellulaire, des fibres de tissu conjonctif et d'autres matériaux particulaires de grande taille. Ces composants indésirables peuvent affecter la qualité physique de la suspension cellulaire et peuvent interférer avec le comptage cellulaire ultérieur, l'ajustement de la concentration, le pipetage et la capture de cellules uniques.

Un filtre cellulaire fournit une étape de filtration physique simple basée principalement sur la taille des particules. Lorsque l'échantillon dissocié traverse le maillage, les fragments tissulaires plus volumineux et les matériaux particulaires sont retenus, tandis que les cellules individuelles et les populations cellulaires de taille appropriée passent à travers. Cela contribue à réduire les débris visibles et les composants structurels de grande taille dans la suspension finale, sans nécessiter de traitement chimique supplémentaire.

Cet effet peut être particulièrement important pour les échantillons de tissus solides, tels que les biopsies tissulaires et autres spécimens biologiques complexes, où la matrice extracellulaire et les structures de tissu conjonctif peuvent subsister après la digestion enzymatique. En réduisant ces composants de grande taille avant le traitement en aval, les filtres cellulaires peuvent contribuer à produire une suspension de départ plus propre et plus homogène. Cela peut faciliter le comptage cellulaire, améliorer la manipulation des échantillons et réduire le potentiel d'interférence des grandes particules avec les systèmes microfluidiques ou de capture cellulaire.

Cependant, la filtration doit être considérée comme une étape complémentaire de préparation des échantillons plutôt que comme un substitut à une dissociation tissulaire efficace. L'efficacité de l'élimination des débris dépend de facteurs tels que le type de tissu, la méthode de dissociation, la taille du maillage, le volume de l'échantillon et les caractéristiques physiques du matériau indésirable. Des tailles de maillage excessivement petites peuvent également augmenter la perte cellulaire ou la rétention de populations cellulaires souhaitables. Par conséquent, la taille de pores du filtre appropriée doit être sélectionnée en fonction de la taille des cellules cibles et des caractéristiques de l'échantillon.

• Réduction des agrégats cellulaires

L'agrégation cellulaire est un autre défi majeur lors de la préparation d'échantillons pour le séquençage de cellules uniques. Idéalement, la suspension de départ devrait contenir des cellules individuelles bien dispersées. En pratique, cependant, les cellules peuvent rester attachées les unes aux autres après la dissociation tissulaire et former des agrégats de petite ou grande taille. Ces agrégats peuvent réduire l'uniformité de la suspension et peuvent interférer avec le comptage cellulaire précis, le chargement de l'échantillon et la capture de cellules uniques en aval.

Plusieurs facteurs peuvent contribuer à l'agrégation cellulaire, notamment une dissociation enzymatique ou mécanique incomplète, l'adhésion cellule-cellule, la matrice extracellulaire résiduelle, l'ADN extracellulaire libéré par les cellules endommagées, une concentration cellulaire excessive et une manipulation inappropriée de l'échantillon. Les cellules mortes ou endommagées peuvent également libérer des composants cellulaires qui augmentent la viscosité de la suspension ou favorisent les interactions entre les cellules.

Un filtre cellulaire correctement sélectionné peut contribuer à réduire les agrégats plus volumineux par exclusion physique basée sur la taille. Lorsque la suspension cellulaire traverse le maillage, les amas de grande taille sont plus susceptibles d'être retenus, tandis que les cellules individuelles et les structures plus petites peuvent passer à travers. Cela peut améliorer l'uniformité physique de la suspension et réduire le nombre de grands agrégats entrant dans les flux de travail de cellules uniques en aval.

La réduction des agrégats est particulièrement pertinente pour les plateformes qui reposent sur le partitionnement ou la capture de cellules individuelles. Si deux cellules ou plus sont introduites dans la même unité de capture, le profil moléculaire résultant peut représenter plus d'une cellule. Dans le séquençage d'ARN de cellules uniques basé sur des gouttelettes, par exemple, la capture simultanée de plusieurs cellules peut contribuer à la formation de doublets ou de multiplets. Ces événements peuvent compliquer l'analyse des données en aval et rendre l'identification précise des types cellulaires plus difficile.

Cependant, les filtres cellulaires ne doivent pas être considérés comme une solution complète d'élimination des doublets. L'efficacité de la filtration dépend fortement de la taille du maillage et de la taille des agrégats, ce qui signifie que les agrégats plus petits peuvent encore passer à travers le filtre. De plus, des doublets peuvent se former après la filtration lors de la manipulation ultérieure de l'échantillon, de l'ajustement de la concentration, de la centrifugation ou des procédures de capture cellulaire. Par conséquent, la filtration peut réduire la charge physique des agrégats plus volumineux, mais elle ne peut pas complètement empêcher les doublets.

Pour cette raison, le filtrage cellulaire doit être combiné avec une dissociation tissulaire appropriée, une manipulation douce des échantillons, une concentration cellulaire adaptée et une détection computationnelle des doublets en aval lorsque cela est nécessaire. L'objectif n'est pas simplement d'éliminer autant d'amas cellulaires que possible, mais d'obtenir une suspension stable contenant une proportion élevée de cellules cibles viables et bien dispersées tout en minimisant la perte cellulaire inutile.

Comment les tamis à cellules influencent-ils le taux de réussite du séquençage monocellulaire ?

L'influence des filtres cellulaires sur le séquençage de cellules uniques est principalement indirecte. Un filtre cellulaire n'améliore pas directement la chimie de séquençage, l'amplification de la bibliothèque ou la précision du séquençage. Sa fonction principale est plutôt d'améliorer la qualité physique de la suspension cellulaire avant la capture de cellules uniques. Pour le séquençage d'ARN de cellules uniques (scRNA-seq) et d'autres flux de travail de séquençage de cellules uniques, la qualité de la suspension de départ est critique. Idéalement, l'échantillon devrait contenir des cellules individuelles saines, intactes et bien dispersées, avec un minimum de débris tissulaires, de fragments de matrice extracellulaire et de grands agrégats cellulaires.

Un filtre cellulaire approprié peut éliminer les particules indésirables et les agrégats plus volumineux tout en permettant aux cellules individuelles et aux composants plus petits de passer à travers. Cela peut rendre la suspension plus homogène et plus facile à traiter lors du comptage cellulaire, de l'ajustement de la concentration et de la capture de cellules uniques.

La relation peut être résumée comme suit : Filtre cellulaire approprié → Suspension cellulaire plus propre et plus uniforme → Qualité de singulet améliorée et grands agrégats réduits →
Capture cellulaire plus cohérente → Préparation de bibliothèque plus fiable →
Qualité des données et interprétabilité améliorées.

Cependant, il est important de comprendre qu'un filtre cellulaire n'est qu'un facteur parmi d'autres affectant les performances du séquençage de cellules uniques. Les conditions de dissociation tissulaire, la viabilité cellulaire, la concentration cellulaire, le temps de manipulation de l'échantillon, la température, la centrifugation, l'élimination des cellules mortes et la plateforme spécifique de cellules uniques peuvent également avoir des effets majeurs.

• Amélioration de l'uniformité physique des suspensions cellulaires

Le premier effet le plus direct d'un filtre cellulaire est l'amélioration de l'uniformité physique de la suspension cellulaire. Après la dissociation tissulaire, l'échantillon contient rarement uniquement des cellules individuelles. Selon le type de tissu et la méthode de dissociation, la suspension peut contenir des cellules individuelles, de petits amas cellulaires, de grands agrégats cellulaires, des fragments tissulaires non dissociés, du matériel de matrice extracellulaire, des débris cellulaires, du matériel fibreux et d'autres contaminants particulaires. Ces structures de grande taille peuvent interférer avec le traitement de cellules uniques en aval en obstruant les embouts de pipette, en affectant le comptage cellulaire automatisé, en perturbant les systèmes microfluidiques ou en étant introduites involontairement dans le processus de capture de cellules uniques. Un filtre cellulaire fournit une étape de séparation physique simple basée principalement sur la taille des particules. Lorsque la suspension traverse le maillage, les structures indésirables plus volumineuses sont retenues tandis que les cellules de taille appropriée passent à travers. Cela contribue à réduire la contamination particulaire et les grands agrégats, résultant en une suspension cellulaire plus homogène qui est plus facile à pipeter, compter, traiter et introduire dans les flux de travail de cellules uniques en aval.

• Réduction des agrégats cellulaires

L'agrégation cellulaire est un problème courant lors de la préparation d'échantillons pour le séquençage de cellules uniques. Après la dissociation tissulaire, les cellules peuvent rester attachées en raison d'une digestion incomplète, d'une perturbation mécanique insuffisante, d'une matrice extracellulaire résiduelle ou d'une concentration cellulaire élevée. Les grands agrégats peuvent interférer avec la capture de cellules uniques et peuvent augmenter le risque de doublets, où deux cellules ou plus sont capturées ensemble et produisent des profils moléculaires mixtes. Les filtres cellulaires contribuent à réduire les agrégats plus volumineux en retenant les amas cellulaires surdimensionnés tout en permettant aux cellules individuelles de taille appropriée de passer à travers. Cela améliore l'uniformité et la qualité de la suspension cellulaire de départ avant l'analyse de cellules uniques en aval. Cependant, la filtration ne peut pas complètement éliminer les doublets et doit être utilisée conjointement avec une dissociation tissulaire appropriée, une manipulation des échantillons et une détection des doublets en aval.

• Effet sur la capture de cellules uniques

La qualité de la suspension cellulaire de départ peut affecter la cohérence de la capture de cellules uniques. Les plateformes de séquençage de cellules uniques exigent généralement que les cellules soient bien dispersées et dans une plage de concentration appropriée. Si la suspension contient de grands agrégats cellulaires, des fragments tissulaires ou des débris excessifs, ces matériaux peuvent interférer avec le comptage cellulaire, le chargement de l'échantillon et les processus de capture en aval. Un filtre cellulaire aide à éliminer les particules et agrégats plus volumineux tout en permettant aux cellules individuelles de passer à travers, résultant en une suspension plus propre et plus uniforme. Cela peut améliorer le comptage cellulaire et l'ajustement de la concentration et réduire les interférences potentielles pendant les processus microfluidiques ou de capture de cellules uniques. Par conséquent, une filtration appropriée peut contribuer à rendre le chargement de l'échantillon et la capture de cellules uniques plus cohérents et prévisibles.

• Soutien à une meilleure préparation de bibliothèque

Les filtres cellulaires n'améliorent pas directement la préparation de bibliothèque, mais ils peuvent soutenir ce processus en améliorant la qualité de la suspension cellulaire de départ. L'élimination des grands agrégats cellulaires, des fragments tissulaires et des débris peut contribuer à fournir un apport cellulaire plus cohérent, une capture cellulaire plus prévisible et des échantillons plus propres pour le traitement en aval. Cela peut contribuer à une préparation de bibliothèque plus cohérente et à une meilleure représentation des cellules individuelles. Cependant, la qualité de la bibliothèque dépend également de facteurs tels que la viabilité cellulaire, l'intégrité de l'ARN, la manipulation des échantillons, la transcription inverse, l'amplification et les conditions de séquençage. Par conséquent, les filtres cellulaires doivent être considérés comme un outil de préparation d'échantillons en amont plutôt que comme un facteur direct dans la chimie de préparation de bibliothèque.

• Effet sur la qualité des données et l'interprétabilité

La filtration n'améliore pas directement les données de séquençage, mais elle peut soutenir une meilleure qualité des données en améliorant la suspension cellulaire de départ. L'élimination des grands agrégats cellulaires, des fragments tissulaires et des débris peut réduire les interférences techniques potentielles, améliorer l'identification des cellules individuelles et soutenir un contrôle qualité plus fiable. Dans le scRNA-seq, une suspension plus propre peut également réduire l'impact des agrégats et d'autres artefacts de préparation d'échantillons, rendant l'identification des types cellulaires et l'interprétation biologique plus fiables. Cependant, la filtration seule ne peut pas garantir des données de haute qualité, car la qualité du séquençage dépend également de la dissociation tissulaire, de la viabilité cellulaire, de la préparation de bibliothèque, de la profondeur de séquençage et du contrôle qualité bioinformatique.

Résumé 

Les filtres cellulaires jouent un rôle de soutien important dans la préparation d'échantillons de cellules uniques en éliminant les grands fragments tissulaires et les agrégats cellulaires, contribuant ainsi à produire une suspension cellulaire plus propre et plus uniforme pour le traitement en aval. Bien qu'ils ne puissent pas déterminer indépendamment le succès du séquençage de cellules uniques, une sélection appropriée du filtre et une filtration douce peuvent améliorer la cohérence des échantillons et réduire la perte cellulaire inutile. En fin de compte, l'objectif n'est pas une filtration maximale, mais l'obtention d'une suspension de cellules uniques de haute qualité, viable et bien dispersée qui fournit une base fiable pour la capture de cellules uniques, la préparation de bibliothèque et le séquençage.