Le piastre per coltura cellulare sono materiali di consumo da laboratorio ampiamente utilizzati per la crescita, il mantenimento, il trattamento e l'analisi delle cellule in condizioni controllate. Il loro design multi-pozzetto consente ai ricercatori di eseguire simultaneamente più condizioni sperimentali utilizzando volumi relativamente ridotti di terreno di coltura e reagenti. L'uso corretto di una piastra per coltura cellulare richiede più della semplice aggiunta di cellule e terreno di coltura. Il tipo cellulare, la densità di semina, il trattamento della superficie, la composizione del terreno, le condizioni di incubazione e la tecnica asettica possono tutti influenzare l'adesione cellulare, la crescita, la morfologia e la riproducibilità sperimentale. Questa guida spiega cosa sono le piastre per coltura cellulare, come selezionare il formato appropriato, come usarle correttamente e come evitare problemi comuni durante la coltura cellulare.

Che cos'è una piastra per coltura cellulare?

Una piastra per coltura cellulare, chiamata anche piastra multi-pozzetto per coltura cellulare, è un contenitore da laboratorio con più pozzetti individuali per la crescita cellulare e il trattamento sperimentale. Ogni pozzetto funziona come una piccola camera di coltura indipendente. I ricercatori possono aggiungere cellule, terreno di coltura, farmaci, reagenti o altri trattamenti a singoli pozzetti, consentendo di testare in parallelo diversi gruppi sperimentali. Le piastre per coltura cellulare sono comunemente prodotte in polistirene (PS). Per la coltura di cellule aderenti, la superficie di crescita è spesso trattata per coltura tissutale (TC-treated) per migliorare la bagnabilità della superficie e supportare l'adesione cellulare.

Come scegliere la piastra per coltura cellulare giusta?

Come utilizzare una piastra per coltura cellulare passo dopo passo?

Le piastre per coltura cellulare sono ampiamente utilizzate per la coltura cellulare, il trattamento farmacologico, i saggi di proliferazione cellulare, gli studi di citotossicità e lo screening ad alta produttività. La corretta gestione di una piastra per coltura cellulare influisce sull'adesione cellulare, sulla crescita, sulla vitalità, sulla riproducibilità sperimentale e sulle prestazioni dei saggi a valle. Quando si utilizza una piastra per coltura cellulare, il flusso di lavoro comprende generalmente il controllo della piastra, la preparazione del terreno di coltura, la preparazione della sospensione cellulare, il calcolo della densità di semina, la semina delle cellule e l'incubazione della piastra. La seguente procedura è applicabile a molti esperimenti di routine di coltura cellulare di mammiferi, ma i parametri specifici devono sempre essere adattati in base al tipo cellulare, al terreno di coltura e al protocollo sperimentale.

Ispezionare la piastra per coltura cellulare

Prima di iniziare la coltura cellulare, ispezionare l'imballaggio, le condizioni fisiche, le informazioni sulla sterilità e la data di scadenza della piastra per coltura cellulare. Anche quando una piastra è etichettata come sterile, è sempre necessario eseguire un'ispezione pre-uso.

Controllare l'integrità dell'imballaggio: Verificare che l'imballaggio esterno o sterile sia integro e privo di strappi, perforazioni, aperture o evidenti danni da umidità. Un imballaggio sterile danneggiato può compromettere la sterilità del prodotto.

Controllare la data di scadenza e le informazioni sul prodotto: Verificare che il prodotto sia entro il periodo di scadenza e controllare l'etichetta per tipo di prodotto, formato dei pozzetti, specifiche, numero di lotto e stato di sterilizzazione. Diversi formati di pozzetti offrono diverse aree di crescita e volumi di lavoro raccomandati. Pertanto, confermare che il formato della piastra selezionato corrisponda al disegno sperimentale prima dell'uso.

Ispezionare per danni fisici: Dopo aver aperto l'imballaggio, ispezionare la piastra per crepe, deformazioni, danni, sbavature o altri difetti di fabbricazione visibili. Prestare particolare attenzione al fondo di ciascun pozzetto, poiché anomalie sulla superficie di coltura possono influenzare l'adesione cellulare e l'osservazione microscopica.

Ispezionare la superficie di coltura: Per le cellule aderenti, confermare che la piastra abbia un trattamento superficiale appropriato per l'adesione cellulare. Le piastre trattate per coltura tissutale (TC-treated) sono comunemente utilizzate per molti tipi di cellule aderenti di mammiferi. Se l'esperimento richiede una superficie specializzata, come una superficie a bassa adesione, un rivestimento di collagene o un altro rivestimento di matrice extracellulare, selezionare la piastra appropriata in base al tipo cellulare e all'obiettivo sperimentale.

Preparare il terreno di coltura

Il terreno di coltura fornisce alle cellule nutrienti, sali inorganici, componenti tampone e altri fattori necessari per la crescita. Diversi tipi cellulari hanno diversi requisiti nutrizionali, quindi il terreno deve essere selezionato secondo le raccomandazioni del fornitore delle cellule o un protocollo sperimentale validato. Prima dell'uso, verificare il nome del terreno, il numero di lotto, le condizioni di conservazione e la data di scadenza. Aggiungere siero, fattori di crescita o altri supplementi quando richiesti dal protocollo sperimentale.

Pre-equilibrazione del terreno di coltura: Per i sistemi di coltura cellulare che richiedono condizioni specifiche di temperatura o CO₂, il terreno di coltura potrebbe dover essere portato alla temperatura appropriata ed equilibrato nelle condizioni richieste prima dell'uso. La pre-equilibrazione aiuta a minimizzare i cambiamenti ambientali subiti dalle cellule durante la manipolazione. Tuttavia, il terreno di coltura non deve essere esposto ripetutamente o inutilmente a temperatura ambiente o a condizioni di incubazione per periodi prolungati. I terreni contenenti componenti sensibili alla temperatura devono essere manipolati secondo le raccomandazioni del fornitore.

Preparare la sospensione cellulare

Per le cellule aderenti, le cellule vengono generalmente staccate dal contenitore di coltura esistente e preparate come una sospensione uniforme di singole cellule o piccoli aggregati cellulari prima di essere trasferite in una nuova piastra per coltura cellulare.

Rimuovere il terreno esaurito: Rimuovere il terreno di coltura esaurito minimizzando la perturbazione diretta dello strato cellulare.

Lavare con PBS: Lavare le cellule con una quantità appropriata di PBS secondo il protocollo di coltura per rimuovere i componenti residui del terreno. Il numero di lavaggi e la procedura di lavaggio possono variare tra i tipi cellulari, quindi una singola condizione di lavaggio non deve essere considerata universale.

Aggiungere la soluzione di distacco: Per le cellule aderenti che richiedono il distacco enzimatico, aggiungere una soluzione appropriata di dissociazione cellulare, come tripsina o un altro reagente di dissociazione validato. Il tempo di distacco deve essere ottimizzato in base al tipo cellulare, alle condizioni cellulari e al reagente di dissociazione. Una digestione eccessiva può influenzare l'integrità della membrana cellulare e la vitalità, mentre una digestione insufficiente può comportare un distacco cellulare incompleto.

Neutralizzare il reagente di distacco: Una volta che le cellule raggiungono lo stato di distacco appropriato, aggiungere un terreno di coltura appropriato per neutralizzare il reagente di dissociazione e pipettare delicatamente per disperdere le cellule. Evitare un'eccessiva formazione di bolle durante la pipettatura, poiché un'eccessiva sollecitazione meccanica può danneggiare alcuni tipi cellulari sensibili.

Contare le cellule: Prima della semina, determinare la concentrazione cellulare e, quando appropriato, valutare la vitalità cellulare. Un calcolo comune è: Concentrazione cellulare = Numero di cellule contate ÷ Volume del campione. Quando si utilizza un emocitometro o un contatore cellulare automatico, seguire la procedura validata per il metodo di conteggio o lo strumento specifico.

Calcolare la densità di semina cellulare

La densità di semina cellulare è un parametro critico negli esperimenti di coltura cellulare. Una densità eccessivamente alta può causare il raggiungimento rapido di un'elevata confluenza e alterare il comportamento cellulare, mentre una densità eccessivamente bassa può comportare crescita lenta, scarsa adesione o maggiore variabilità tra pozzetti. La formula di base è:

Densità di semina cellulare = Numero di cellule seminate ÷ Area di crescita

Qui, Area di crescita si riferisce all'area di crescita effettiva del pozzetto di coltura. Se la densità di semina target e l'area di crescita sono note, il numero di cellule richiesto può essere calcolato come:

Numero di cellule richiesto = Densità di semina target × Area di crescita

Ad esempio, se la densità di semina target è 1 × 10⁵ cellule/cm² e l'area di crescita di un pozzetto è 2 cm², il numero di cellule richiesto per pozzetto è: 1 × 10⁵ × 2 = 2 × 10⁵ cellule/pozzetto.

Seminare le cellule nella piastra di coltura

Dopo il conteggio cellulare e il calcolo del numero di cellule richiesto, dispensare il volume appropriato di sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra di coltura.

Pipettare delicatamente: Dispensare la sospensione cellulare lentamente e in modo costante per evitare un'erogazione forzata. Per le cellule fragili, una forza fluida eccessiva può influenzare la vitalità cellulare, quindi l'intensità della pipettatura deve essere adattata al tipo cellulare.

Minimizzare la formazione di bolle: Evitare un'eccessiva formazione di bolle durante l'erogazione. Le bolle possono causare una distribuzione cellulare non uniforme e interferire con l'osservazione microscopica. Se si formano bolle evidenti in un pozzetto, rimuoverle secondo la procedura stabilita dal laboratorio, evitando movimenti vigorosi della piastra.

Garantire una distribuzione cellulare uniforme: Dopo la semina, assicurarsi che la sospensione cellulare sia distribuita uniformemente sul fondo di ciascun pozzetto. Una distribuzione non uniforme può creare aree localizzate di alta e bassa densità cellulare. Ciò è particolarmente importante per le piastre a 96 pozzetti e altri formati a pozzetti piccoli, poiché piccole differenze nella manipolazione possono avere un effetto maggiore quando si lavora con volumi ridotti.

Evitare il contatto ripetuto tra la punta e la superficie di coltura: Non raschiare ripetutamente il fondo del pozzetto con la punta della pipetta. Per le cellule aderenti, la superficie di coltura è direttamente associata all'adesione e alla crescita cellulare.

Muovere delicatamente la piastra: Dopo la semina, muovere delicatamente la piastra avanti e indietro e da un lato all'altro con un movimento costante e validato per aiutare a distribuire uniformemente le cellule. Evitare un'agitazione circolare vigorosa, poiché potrebbe causare l'accumulo di cellule verso il centro o i bordi del pozzetto.

Posizionare la piastra nell'incubatore per coltura cellulare: Dopo la semina, trasferire prontamente la piastra in un ambiente di incubazione adatto alle cellule. I principali parametri di incubazione includono temperatura, concentrazione di CO₂, umidità e tempo di incubazione.

Temperatura: Per molte colture cellulari di mammiferi, una temperatura di incubazione comunemente utilizzata è 37°C. Tuttavia, la temperatura effettiva deve essere determinata dal tipo cellulare e dal sistema di coltura.

Concentrazione di CO₂: Per i terreni che utilizzano un sistema tampone a base di bicarbonato, la concentrazione di CO₂ deve essere compatibile con il sistema tampone del terreno. Molti sistemi di coltura cellulare di mammiferi di routine utilizzano circa 5% di CO₂, ma la condizione specifica deve essere determinata in base al terreno e ai requisiti cellulari.