تُعد أطباق زراعة الخلايا من المستهلكات المخبرية المستخدمة على نطاق واسع لتنمية الخلايا وصيانتها ومعالجتها وتحليلها في ظل ظروف مضبوطة. يتيح تصميمها متعدد الآبار للباحثين إجراء ظروف تجريبية متعددة في وقت واحد مع استخدام أحجام صغيرة نسبيًا من الوسط الزرعي والكواشف. يتطلب الاستخدام السليم لطبق زراعة الخلايا أكثر من مجرد إضافة الخلايا والوسط الزرعي. إذ يمكن أن يؤثر نوع الخلايا، وكثافة التلقيح، والمعالجة السطحية، وتركيب الوسط الزرعي، وظروف الحضانة، والتقنية المعقمة جميعها على التصاق الخلايا ونموها وشكلها وقابلية تكرار النتائج التجريبية. يشرح هذا الدليل ما هي أطباق زراعة الخلايا، وكيفية اختيار النوع المناسب، وكيفية استخدامها بشكل صحيح، وكيفية تجنب المشكلات الشائعة أثناء زراعة الخلايا.

ما هي لوحة زراعة الخلايا؟

طبق زراعة الخلايا، ويُسمى أيضًا طبق زراعة الخلايا متعدد الآبار، هو وعاء مخبري يحتوي على آبار فردية متعددة لنمو الخلايا والمعالجة التجريبية. يعمل كل بئر كحجرة زراعة مستقلة صغيرة. يمكن للباحثين إضافة الخلايا والوسط الزرعي والأدوية والكواشف أو معالجات أخرى إلى آبار فردية، مما يسمح باختبار مجموعات تجريبية مختلفة بالتوازي. تُصنع أطباق زراعة الخلايا عادةً من البوليستيرين (PS). ولزراعة الخلايا الملتصقة، غالبًا ما تُعالج أسطح النمو معالجةً نسيجية (TC-treated) لتحسين قابلية التبلل السطحي ودعم التصاق الخلايا.

كيف تختار طبق زراعة الخلايا المناسب؟

كيف تستخدم طبق زراعة الخلايا خطوة بخطوة؟

تُستخدم أطباق زراعة الخلايا على نطاق واسع في زراعة الخلايا، والمعالجة الدوائية، وفحوصات تكاثر الخلايا، ودراسات السمية الخلوية، والفحص عالي الإنتاجية. يؤثر التعامل السليم مع طبق زراعة الخلايا على التصاق الخلايا ونموها وقابليتها للحياة وقابلية تكرار النتائج التجريبية وأداء الفحوصات النهائية. عند استخدام طبق زراعة الخلايا، يتضمن سير العمل عمومًا فحص الطبق، وتحضير الوسط الزرعي، وتحضير معلق الخلايا، وحساب كثافة التلقيح، وتلقيح الخلايا، وحضانة الطبق. ينطبق الإجراء التالي على العديد من تجارب زراعة الخلايا الثديية الروتينية، ولكن يجب دائمًا تعديل المعايير المحددة وفقًا لنوع الخلايا والوسط الزرعي والبروتوكول التجريبي.

• فحص طبق زراعة الخلايا

قبل بدء زراعة الخلايا، افحص العبوة والحالة الفيزيائية ومعلومات التعقيم وتاريخ انتهاء صلاحية طبق زراعة الخلايا. حتى عندما يُشار إلى أن الطبق معقم، يجب دائمًا إجراء فحص قبل الاستخدام.

فحص سلامة العبوة: تحقق من أن العبوة الخارجية أو المعقمة سليمة وخالية من التمزقات أو الثقوب أو الفتحات أو أضرار الرطوبة الواضحة. قد تؤدي العبوات المعقمة التالفة إلى المساس بتعقيم المنتج.

فحص تاريخ انتهاء الصلاحية ومعلومات المنتج: تحقق من أن المنتج ضمن فترة صلاحيته وافحص الملصق بحثًا عن نوع المنتج وتنسيق الآبار والمواصفات ورقم الدفعة وحالة التعقيم. توفر تنسيقات الآبار المختلفة مساحات نمو مختلفة وأحجام عمل موصى بها. لذلك، تأكد من أن تنسيق الطبق المختار يطابق التصميم التجريبي قبل الاستخدام.

فحص الأضرار الفيزيائية: بعد فتح العبوة، افحص الطبق بحثًا عن التشققات أو التشوهات أو التلف أو النتوءات أو أي عيوب تصنيع مرئية أخرى. انتبه بشكل خاص إلى قاع كل بئر لأن التشوهات على سطح الزراعة قد تؤثر على التصاق الخلايا والملاحظة المجهرية.

فحص سطح الزراعة: بالنسبة للخلايا الملتصقة، تأكد من أن الطبق يحتوي على معالجة سطحية مناسبة لالتصاق الخلايا. تُستخدم الأطباق المعالجة نسيجيًا (TC-treated) بشكل شائع للعديد من أنواع الخلايا الثديية الملتصقة. إذا كانت التجربة تتطلب سطحًا متخصصًا، مثل سطح منخفض الالتصاق أو طلاء كولاجين أو طلاء مصفوفة خارج خلوية أخرى، فاختر الطبق المناسب وفقًا لنوع الخلايا والهدف التجريبي.

• تحضير الوسط الزرعي

يوفر الوسط الزرعي للخلايا العناصر الغذائية والأملاح غير العضوية والمكونات المنظمة والعوامل الأخرى المطلوبة للنمو. تختلف المتطلبات الغذائية باختلاف أنواع الخلايا، لذلك يجب اختيار الوسط وفقًا لتوصيات مورد الخلايا أو بروتوكول تجريبي مُتحقق منه. قبل الاستخدام، تحقق من اسم الوسط ورقم الدفعة وظروف التخزين وتاريخ انتهاء الصلاحية. أضف المصل أو عوامل النمو أو المكملات الأخرى عندما يتطلب البروتوكول التجريبي ذلك.

المعادلة المسبقة للوسط الزرعي: بالنسبة لأنظمة زراعة الخلايا التي تتطلب ظروف حرارة أو ثاني أكسيد كربون محددة، قد يحتاج الوسط الزرعي إلى الوصول إلى درجة الحرارة المناسبة والمعادلة في الظروف المطلوبة قبل الاستخدام. تساعد المعادلة المسبقة في تقليل التغيرات البيئية التي تتعرض لها الخلايا أثناء التعامل. ومع ذلك، لا ينبغي تعريض الوسط الزرعي بشكل متكرر أو غير ضروري لدرجة حرارة الغرفة أو ظروف الحضانة لفترات طويلة. يجب التعامل مع الأوساط التي تحتوي على مكونات حساسة للحرارة وفقًا لتوصيات المورد.

• تحضير معلق الخلايا

بالنسبة للخلايا الملتصقة، تُفصل الخلايا عمومًا عن الوعاء الزرعي الحالي وتُحضر كمعلق موحد من خلايا مفردة أو مجموعات خلوية صغيرة قبل نقلها إلى طبق زراعة خلايا جديد.

إزالة الوسط المستهلك: أزل الوسط الزرعي المستهلك مع تقليل الاضطراب المباشر لطبقة الخلايا.

الغسيل بمحلول PBS: اغسل الخلايا بكمية مناسبة من محلول PBS وفقًا لبروتوكول الزراعة لإزالة مكونات الوسط المتبقية. قد يختلف عدد مرات الغسيل وإجراءات الغسيل بين أنواع الخلايا، لذلك لا ينبغي اعتبار حالة غسيل واحدة شاملة.

إضافة محلول الفصل: بالنسبة للخلايا الملتصقة التي تتطلب فصلًا إنزيميًا، أضف محلول فصل خلوي مناسب، مثل التربسين أو كاشف فصل آخر مُتحقق منه. يجب تحسين وقت الفصل وفقًا لنوع الخلايا وحالتها وكاشف الفصل. قد يؤثر الهضم المفرط على سلامة غشاء الخلية وقابليتها للحياة، بينما قد يؤدي الهضم غير الكافي إلى فصل غير كامل للخلايا.

تحييد كاشف الفصل: بمجرد وصول الخلايا إلى حالة الفصل المناسبة، أضف وسطًا زرعيًا مناسبًا لتحييد كاشف الفصل وامزج بلطف باستخدام الماصة لتشتيت الخلايا. تجنب تكوين فقاعات مفرطة أثناء المزج لأن القص الميكانيكي المفرط قد يتلف بعض أنواع الخلايا الحساسة.

عد الخلايا: قبل التلقيح، حدد تركيز الخلايا، وعند الاقتضاء، قيّم قابلية الخلايا للحياة. الحساب الشائع هو: تركيز الخلايا = عدد الخلايا المعدودة ÷ حجم العينة. عند استخدام شريحة عد أو عداد خلايا آلي، اتبع الإجراء المُتحقق منه لطريقة العد أو الجهاز المحدد.

• حساب كثافة تلقيح الخلايا

تُعد كثافة تلقيح الخلايا معلمة حاسمة في تجارب زراعة الخلايا. قد تؤدي الكثافة المرتفعة بشكل مفرط إلى وصول الخلايا إلى درجة التقاء عالية بسرعة وتغيير السلوك الخلوي، بينما قد تؤدي الكثافة المنخفضة بشكل مفرط إلى نمو بطيء أو التصاق ضعيف أو زيادة التباين بين الآبار. الصيغة الأساسية هي:

كثافة تلقيح الخلايا = عدد الخلايا الملقحة ÷ مساحة النمو

هنا، تشير مساحة النمو إلى مساحة النمو الفعالة لبئر الزراعة. إذا كانت كثافة التلقيح المستهدفة ومساحة النمو معروفتين، يمكن حساب العدد المطلوب من الخلايا على النحو التالي:

عدد الخلايا المطلوب = كثافة التلقيح المستهدفة × مساحة النمو

على سبيل المثال، إذا كانت كثافة التلقيح المستهدفة هي 1 × 10⁵ خلية/سم² ومساحة نمو البئر الواحد هي 2 سم²، فإن العدد المطلوب من الخلايا لكل بئر هو: 1 × 10⁵ × 2 = 2 × 10⁵ خلية/بئر.

• تلقيح الخلايا في طبق الزراعة

بعد عد الخلايا وحساب العدد المطلوب، وزّع الحجم المناسب من معلق الخلايا في كل بئر من آبار طبق الزراعة. 

المزج بلطف باستخدام الماصة: وزّع معلق الخلايا ببطء وبشكل ثابت لتجنب الدفع القوي. بالنسبة للخلايا الهشة، قد يؤثر الضغط السائل المفرط على قابلية الخلايا للحياة، لذلك يجب ضبط شدة المزج وفقًا لنوع الخلايا.

تقليل تكوين الفقاعات: تجنب التكوين المفرط للفقاعات أثناء التوزيع. يمكن أن تسبب الفقاعات توزيعًا غير متساوٍ للخلايا وتتداخل مع الملاحظة المجهرية. إذا تشكلت فقاعات واضحة في بئر، أزلها وفقًا للإجراء المعتمد في المختبر مع تجنب الحركة العنيفة للطبق.

ضمان التوزيع المنتظم للخلايا: بعد التلقيح، تأكد من توزيع معلق الخلايا بالتساوي عبر قاع كل بئر. يمكن أن يؤدي التوزيع غير المتساوي إلى مناطق موضعية ذات كثافة خلوية عالية ومنخفضة. هذا مهم بشكل خاص للأطباق ذات 96 بئرًا وتنسيقات الآبار الصغيرة الأخرى لأن الاختلافات الصغيرة في التعامل يمكن أن يكون لها تأثير أكبر عند العمل بأحجام منخفضة.

تجنب التلامس المتكرر بين طرف الماصة وسطح الزراعة: لا تكشط قاع البئر بشكل متكرر بطرف الماصة. بالنسبة للخلايا الملتصقة، يرتبط سطح الزراعة ارتباطًا مباشرًا بالتصاق الخلايا ونموها. 

تحريك الطبق بلطف: بعد التلقيح، حرّك الطبق بلطف ذهابًا وإيابًا ومن جانب إلى جانب باستخدام حركة ثابتة ومُتحقق منها للمساعدة في توزيع الخلايا بالتساوي. تجنب الاهتزاز الدائري القوي لأنه قد يتسبب في تراكم الخلايا نحو مركز أو حواف البئر.

وضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا: بعد التلقيح، انقل الطبق فورًا إلى بيئة حضانة مناسبة للخلايا. تشمل معايير الحضانة الرئيسية درجة الحرارة وتركيز ثاني أكسيد الكربون والرطوبة ووقت الحضانة. 

درجة الحرارة: بالنسبة للعديد من مزارع الخلايا الثديية، تُستخدم درجة حرارة حضانة شائعة تبلغ 37 درجة مئوية. ومع ذلك، يجب تحديد درجة الحرارة الفعلية وفقًا لنوع الخلايا ونظام الزراعة.

تركيز ثاني أكسيد الكربون: بالنسبة للأوساط التي تستخدم نظام تخزين قائم على البيكربونات، يجب أن يكون تركيز ثاني أكسيد الكربون متوافقًا مع نظام التخزين في الوسط. تستخدم العديد من أنظمة زراعة الخلايا الثديية الروتينية حوالي 5% من ثاني أكسيد الكربون، ولكن يجب تحديد الظروف المحددة وفقًا للوسط ومتطلبات الخلايا.

الملخص