As placas de cultura de células são consumíveis de laboratório amplamente utilizados para crescer, manter, tratar e analisar células sob condições controladas. Seu design de múltiplos poços permite que os pesquisadores realizem múltiplas condições experimentais simultaneamente, utilizando volumes relativamente pequenos de meio de cultura e reagentes. O uso adequado de uma placa de cultura de células exige mais do que simplesmente adicionar células e meio de cultura. O tipo celular, a densidade de semeadura, o tratamento da superfície, a composição do meio, as condições de incubação e a técnica asséptica podem afetar a adesão celular, o crescimento, a morfologia e a reprodutibilidade experimental. Este guia explica o que são placas de cultura de células, como selecionar o formato apropriado, como utilizá-las corretamente e como evitar problemas comuns durante a cultura de células.

O que é uma placa de cultura celular?

Uma placa de cultura de células, também chamada de placa de cultura de células de múltiplos poços, é um recipiente de laboratório contendo múltiplos poços individuais para crescimento celular e tratamento experimental. Cada poço funciona como uma pequena câmara de cultura independente. Os pesquisadores podem adicionar células, meio de cultura, fármacos, reagentes ou outros tratamentos a poços individuais, permitindo que diferentes grupos experimentais sejam testados em paralelo. As placas de cultura de células são comumente fabricadas em poliestireno (PS). Para cultura de células aderentes, a superfície de crescimento é frequentemente tratada para cultura de tecidos (tratamento TC) para melhorar a molhabilidade da superfície e suportar a adesão celular.

Como escolher a placa de cultura de células correta?

Como usar uma placa de cultura de células passo a passo?

As placas de cultura de células são amplamente utilizadas para cultura celular, tratamento com fármacos, ensaios de proliferação celular, estudos de citotoxicidade e triagem de alto rendimento. O manuseio adequado de uma placa de cultura de células afeta a adesão celular, o crescimento, a viabilidade, a reprodutibilidade experimental e o desempenho de ensaios downstream. Ao utilizar uma placa de cultura de células, o fluxo de trabalho geralmente inclui a verificação da placa, a preparação do meio de cultura, a preparação da suspensão celular, o cálculo da densidade de semeadura, a semeadura das células e a incubação da placa. O procedimento a seguir é aplicável a muitos experimentos rotineiros de cultura de células de mamíferos, mas parâmetros específicos devem sempre ser ajustados de acordo com o tipo celular, o meio de cultura e o protocolo experimental.

Inspecione a placa de cultura de células

Antes de iniciar a cultura de células, inspecione a embalagem, a condição física, as informações de esterilidade e a data de validade da placa de cultura de células. Mesmo quando uma placa é rotulada como estéril, uma inspeção pré-uso deve sempre ser realizada.

Verifique a integridade da embalagem: Verifique se a embalagem externa ou estéril está intacta e livre de rasgos, perfurações, aberturas ou danos óbvios por umidade. Embalagens estéreis danificadas podem comprometer a esterilidade do produto.

Verifique a data de validade e as informações do produto: Verifique se o produto está dentro do período de validade e confira o rótulo quanto ao tipo de produto, formato dos poços, especificações, número de lote e status de esterilização. Diferentes formatos de poços fornecem diferentes áreas de crescimento e volumes de trabalho recomendados. Portanto, confirme se o formato da placa selecionado corresponde ao desenho experimental antes do uso.

Inspecione quanto a danos físicos: Após abrir a embalagem, inspecione a placa quanto a rachaduras, deformações, danos, rebarbas ou outros defeitos visíveis de fabricação. Preste atenção especial ao fundo de cada poço, pois anormalidades na superfície de cultura podem afetar a adesão celular e a observação microscópica.

Inspecione a superfície de cultura: Para células aderentes, confirme se a placa possui tratamento de superfície apropriado para adesão celular. Placas tratadas para cultura de tecidos (tratamento TC) são comumente utilizadas para muitos tipos de células aderentes de mamíferos. Se o experimento exigir uma superfície especializada, como superfície de baixa adesão, revestimento de colágeno ou outro revestimento de matriz extracelular, selecione a placa apropriada de acordo com o tipo celular e o objetivo experimental.

Prepare o meio de cultura

O meio de cultura fornece às células nutrientes, sais inorgânicos, componentes tamponantes e outros fatores necessários para o crescimento. Diferentes tipos celulares têm diferentes requisitos nutricionais, portanto, o meio deve ser selecionado de acordo com as recomendações do fornecedor das células ou um protocolo experimental validado. Antes do uso, verifique o nome do meio, o número de lote, as condições de armazenamento e a data de validade. Adicione soro, fatores de crescimento ou outros suplementos quando exigidos pelo protocolo experimental.

Pré-equilíbrio do meio de cultura: Para sistemas de cultura de células que exigem condições específicas de temperatura ou CO₂, o meio de cultura pode precisar ser levado à temperatura apropriada e equilibrado sob as condições exigidas antes do uso. O pré-equilíbrio ajuda a minimizar as mudanças ambientais experimentadas pelas células durante o manuseio. No entanto, o meio de cultura não deve ser repetida ou desnecessariamente exposto à temperatura ambiente ou a condições de incubação por períodos prolongados. Meios contendo componentes sensíveis à temperatura devem ser manuseados de acordo com as recomendações do fornecedor.

Prepare a suspensão celular

Para células aderentes, as células são geralmente desprendidas do recipiente de cultura existente e preparadas como uma suspensão uniforme de células únicas ou pequenos agrupamentos celulares antes de serem transferidas para uma nova placa de cultura de células.

Remova o meio gasto: Remova o meio de cultura gasto minimizando a perturbação direta da camada celular.

Lave com PBS: Lave as células com uma quantidade apropriada de PBS de acordo com o protocolo de cultura para remover componentes residuais do meio. O número de lavagens e o procedimento de lavagem podem variar entre tipos celulares, portanto, uma condição única de lavagem não deve ser considerada universal.

Adicione a solução de desprendimento: Para células aderentes que exigem desprendimento enzimático, adicione uma solução apropriada de dissociação celular, como tripsina ou outro reagente de dissociação validado. O tempo de desprendimento deve ser otimizado de acordo com o tipo celular, a condição das células e o reagente de dissociação. A digestão excessiva pode afetar a integridade da membrana celular e a viabilidade, enquanto a digestão insuficiente pode resultar em desprendimento celular incompleto.

Neutralize o reagente de desprendimento: Quando as células atingirem o estado de desprendimento apropriado, adicione um meio de cultura apropriado para neutralizar o reagente de dissociação e pipete suavemente para dispersar as células. Evite a formação excessiva de bolhas durante a pipetagem, pois o cisalhamento mecânico excessivo pode danificar alguns tipos celulares sensíveis.

Conte as células: Antes da semeadura, determine a concentração celular e, quando apropriado, avalie a viabilidade celular. Um cálculo comum é: Concentração celular = Número de células contadas ÷ Volume da amostra. Ao utilizar um hemocitômetro ou contador celular automatizado, siga o procedimento validado para o método de contagem ou instrumento específico.

Calcule a densidade de semeadura celular

A densidade de semeadura celular é um parâmetro crítico em experimentos de cultura de células. Densidade excessivamente alta pode fazer com que as células atinjam alta confluência rapidamente e altere o comportamento celular, enquanto densidade excessivamente baixa pode resultar em crescimento lento, adesão deficiente ou aumento da variabilidade entre poços. A fórmula básica é:

Densidade de semeadura celular = Número de células semeadas ÷ Área de crescimento

Aqui, Área de Crescimento refere-se à área de crescimento efetiva do poço de cultura. Se a densidade de semeadura alvo e a área de crescimento forem conhecidas, o número necessário de células pode ser calculado como:

Número de células necessário = Densidade de semeadura alvo × Área de crescimento

Por exemplo, se a densidade de semeadura alvo for 1 × 10⁵ células/cm² e a área de crescimento de um poço for 2 cm², o número necessário de células por poço é: 1 × 10⁵ × 2 = 2 × 10⁵ células/poço.

Semeie as células na placa de cultura

Após a contagem celular e o cálculo do número necessário de células, distribua o volume apropriado de suspensão celular em cada poço da placa de cultura.

Pipete suavemente: Distribua a suspensão celular lenta e consistentemente para evitar liberação forçada. Para células frágeis, a força excessiva do fluido pode afetar a viabilidade celular, portanto, a intensidade da pipetagem deve ser ajustada de acordo com o tipo celular.

Minimize a formação de bolhas: Evite a formação excessiva de bolhas durante a distribuição. Bolhas podem causar distribuição celular desigual e interferir na observação microscópica. Se bolhas óbvias se formarem em um poço, remova-as de acordo com o procedimento estabelecido do laboratório, evitando movimentos vigorosos da placa.

Garanta a distribuição celular uniforme: Após a semeadura, garanta que a suspensão celular seja distribuída uniformemente no fundo de cada poço. A distribuição desigual pode criar áreas localizadas de alta e baixa densidade celular. Isso é particularmente importante para placas de 96 poços e outros formatos de poços pequenos, pois pequenas diferenças no manuseio podem ter um efeito maior ao trabalhar com volumes baixos.

Evite contato repetido entre a ponteira e a superfície de cultura: Não raspe repetidamente o fundo do poço com a ponteira da pipeta. Para células aderentes, a superfície de cultura está diretamente associada à adesão e ao crescimento celular.

Mova a placa suavemente: Após a semeadura, mova suavemente a placa para frente e para trás e de um lado para o outro usando um movimento consistente e validado para ajudar a distribuir as células uniformemente. Evite agitação circular vigorosa, pois isso pode fazer com que as células se acumulem em direção ao centro ou às bordas do poço.

Coloque a placa na incubadora de cultura de células: Após a semeadura, transfira a placa prontamente para um ambiente de incubação adequado para as células. Os principais parâmetros de incubação incluem temperatura, concentração de CO₂, umidade e tempo de incubação.

Resistência: Para muitas culturas de células de mamíferos, uma temperatura de incubação comumente utilizada é 37°C. No entanto, a temperatura real deve ser determinada pelo tipo celular e pelo sistema de cultura.

Concentração de CO₂: Para meios que utilizam um sistema tamponante à base de bicarbonato, a concentração de CO₂ deve ser compatível com o sistema tamponante do meio. Muitos sistemas rotineiros de cultura de células de mamíferos utilizam aproximadamente 5% de CO₂, mas a condição específica deve ser determinada de acordo com o meio e os requisitos celulares.