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Le fasi di utilizzo di una camera per colture cellulari, come i vetrini per camera Falcon, possono variare a seconda dello scopo sperimentale specifico e del tipo di campione. Di seguito sono riportate le fasi generali:
1. Preparazione
Pulizia e Disinfezione: Assicurarsi che la camera per vetrini per colture cellulari sia pulita e sterile prima dell'uso. Se si tratta di un prodotto nuovo, di solito è pre-sterilizzato e può essere utilizzato direttamente. Se deve essere riutilizzato, pulirlo prima accuratamente con un detergente per rimuovere le impurità residue, quindi risciacquarlo più volte con acqua distillata. Successivamente, può essere sterilizzato in autoclave o pulito con alcol al 75%, quindi lasciato asciugare prima dell'uso.
Preparare i Materiali Sperimentali: Preparare le cellule necessarie, il terreno di coltura, le pipette, i puntali per pipette, i reagenti sterili, ecc. Regolare inoltre gli strumenti sperimentali come la cappa a flusso laminare, la centrifuga e il microscopio in condizioni operative normali.
2. Aggiunta del Campione
Campioni Cellulari: Se utilizzato per esperimenti di coltura cellulare nei vetrini per colture cellulari, sotto cappa a flusso laminare, utilizzare una pipetta per prelevare una quantità adeguata di sospensione cellulare in fase di crescita logaritmica con buono stato cellulare e aggiungerla lentamente a ciascun pozzetto della camera per colture cellulari. In generale, determinare la densità di semina cellulare in base alle dimensioni del pozzetto e ai requisiti sperimentali. Ad esempio, per un comune pozzetto da 4 parti della camera per colture cellulari, il numero di cellule seminate per pozzetto è approssimativamente (1×10⁴-1×10⁵). Dopo la semina, trasferire delicatamente la camera per colture cellulari nell'incubatore per cellule e coltivarla in condizioni appropriate (ad esempio, 37°C, 5% CO2) per consentire l'adesione e la crescita delle cellule.
Campioni Tissutali: Se si osservano sezioni tissutali, pretrattare prima i campioni tissutali mediante fissazione, disidratazione, inclusione, ecc., e preparare sezioni con uno spessore appropriato (solitamente 4-10 μm). Quindi, posizionare con cura le sezioni nel pozzetto della camera per colture cellulari utilizzando delle pinze, assicurandosi che le sezioni siano piatte. È possibile utilizzare una piccola quantità di adesivo (come la poli-L-lisina) per aiutare le sezioni ad aderire meglio al vetrino.
3. Trattamento Sperimentale
Trattamento Farmacologico: Dopo che le cellule sono aderite nella camera per colture cellulari, se si conduce un esperimento farmacologico, secondo il disegno sperimentale, utilizzare una pipetta per aggiungere soluzioni farmacologiche a diverse concentrazioni a ciascun pozzetto e impostare contemporaneamente un gruppo di controllo senza farmaco. Il volume del farmaco deve essere determinato in base alle dimensioni del pozzetto e ai requisiti sperimentali, aggiungendo generalmente 100-500 μL per pozzetto per raggiungere la concentrazione preimpostata del farmaco nel terreno di coltura. Dopo l'aggiunta del farmaco, agitare delicatamente la camera per colture cellulari per distribuire uniformemente il farmaco.
Trattamento di Colorazione: Se si conduce un esperimento di colorazione nella camera per colture cellulari, come la colorazione H&E delle cellule, aspirare prima il terreno di coltura nel pozzetto e risciacquare delicatamente le cellule 2-3 volte con tampone PBS per rimuovere il terreno di coltura residuo. Quindi aggiungere in sequenza la colorazione ematossilina, eosina, ecc. per la colorazione. Il tempo di colorazione è determinato secondo le istruzioni del colorante e i requisiti sperimentali, generalmente 3-5 minuti per la colorazione con ematossilina e 1-3 minuti per la colorazione con eosina. Dopo la colorazione, risciacquare con acqua corrente per rimuovere il colorante in eccesso.
4. Osservazione e Registrazione
Osservazione Microscopica: Dopo il completamento del trattamento, posizionare i vetrini per camera sul tavolino del microscopio. Innanzitutto, individuare l'area del campione con l'obiettivo a basso ingrandimento, quindi passare all'obiettivo ad alto ingrandimento o ad immersione per un'osservazione dettagliata. Durante l'osservazione, prestare attenzione alla regolazione di parametri come messa a fuoco, luminosità e contrasto per ottenere un'immagine chiara. Ad esempio, quando si osserva la morfologia cellulare nella camera per colture cellulari, è possibile osservare caratteristiche come il contorno cellulare, le dimensioni e il rapporto nucleo-citoplasma; quando si osservano sezioni tissutali, è possibile osservare gli strati tissutali e le disposizioni cellulari.
Registrazione dell'Immagine: Se è necessario registrare i risultati sperimentali della camera per vetrini da microscopio, è possibile utilizzare il sistema di imaging del microscopio o una fotocamera digitale collegata per scattare fotografie. Durante lo scatto, selezionare campi visivi rappresentativi e registrare le condizioni di scatto (come ingrandimento, tempo di esposizione, ecc.). Per esperimenti dinamici, come l'osservazione del processo di movimento cellulare nei vetrini per camera da microscopio, è possibile utilizzare la tecnologia di imaging time-lapse per scattare una foto a intervalli regolari e registrare i cambiamenti delle cellule nel tempo.
5. Trattamento Successivo
Pulizia e Conservazione: Se la camera per colture cellulari deve essere riutilizzata, dopo l'esperimento, rimuovere il più presto possibile i campioni e i liquidi dalla camera. Quindi, seguire le fasi di pulizia e disinfezione descritte nella preparazione per trattarla, asciugarla e conservarla adeguatamente.