La PCR (Reazione a Catena della Polimerasi) è una delle tecniche più comunemente utilizzate in biologia molecolare e negli esperimenti diagnostici. La sua accuratezza dipende da molteplici fattori, tra cui il sistema di reazione, la configurazione dello strumento e la qualità dei consumabili. I consumabili per PCR non sono solo contenitori di reazione, ma influenzano direttamente la conduzione termica, la perdita per evaporazione, l'uniformità della reazione e la riproducibilità dei risultati. Scegliere i consumabili giusti può migliorare significativamente i tassi di successo sperimentale e ridurre errori e costi.

1. Cosa sono i consumabili per PCR?

I consumabili per PCR si riferiscono a articoli da laboratorio monouso specificamente progettati per i flussi di lavoro della PCR. Questi articoli sono tipicamente realizzati in polipropilene (PP) ad alta purezza e sono fabbricati per resistere a cicli termici ripetuti, mantenendo al contempo la stabilità chimica e l'integrità del campione. Sono componenti essenziali in biologia molecolare, diagnostica clinica, test genetici e ricerca nelle scienze della vita.

Perché i consumabili per PCR sono generalmente realizzati in polipropilene (PP)?

I consumabili per PCR sono generalmente realizzati in polipropilene (PP) perché è un materiale biologicamente inerte, la sua superficie non aderisce facilmente alle biomolecole e possiede una buona resistenza chimica e tolleranza alle temperature (può essere autoclavato a 121 gradi Celsius e può sopportare le variazioni di temperatura durante i cicli termici). Questi materiali entrano solitamente in contatto diretto con reagenti o campioni; pertanto, durante la produzione sono richiesti materiali di alta qualità e buone tecniche di lavorazione.

2. Tipi comuni di consumabili per PCR

• Provetta PCR Singola

Specifiche principali: Provette PCR da 0,2 ml (tappo piatto/tappo a cupola); Provette PCR da 0,5 ml (tappo piatto).

Tappo piatto Fornisce una trasmissione precisa del segnale di fluorescenza per la qPCR; facilita l'etichettatura. Tappo a cupola Entra in contatto con il coperchio riscaldato dello strumento PCR, riducendo la deformazione della provetta di reazione indotta dalla pressione; tuttavia, influisce sulla trasmissione del segnale di fluorescenza e non può essere utilizzato in esperimenti di qPCR.

• Strisce di Provette PCR

Specifiche principali:

Provette PCR in strisce da 4 (trasparenti). Strisce di 4 provette PCR da 0,1 mL con tappi individuali sono appositamente progettate per gli strumenti QIAGEN®/Corbett Rotor-Gene®. 

Strisce di 8 provette PCR (strisce di provette PCR con tappi attaccati/strisce di 8 provette PCR con tappi attaccati individualmente; bianche/trasparenti). 

Strisce di 12 provette PCR. 

Le provette PCR sono disponibili principalmente in tre colori: trasparente, smerigliato e bianco. Il colore del corpo della provetta non influisce sull'amplificazione del DNA. Tuttavia, negli esperimenti di PCR quantitativa in fluorescenza, rispetto alle provette trasparenti, quelle smerigliate e bianche riducono la perdita di fluorescenza a causa della minore trasmittanza luminosa, consentendo a più segnali di essere riflessi al modulo di rilevamento della fluorescenza, aumentando così il rapporto segnale-rumore. Inoltre, le pareti delle provette bianche e smerigliate possono prevenire meglio l'interferenza del segnale tra i pozzetti, minimizzando le variazioni negli esperimenti ripetuti.

Il modulo di rilevamento della fluorescenza si trova sopra il modulo di riscaldamento (lettura del segnale dall'alto): è possibile utilizzare provette trasparenti, smerigliate e bianche, ma sono più consigliate quelle smerigliate e bianche; rapporto segnale-rumore: bianco > smerigliato > trasparente; ad esempio, con gli strumenti PCR in tempo reale Bio-Rad CFX o Roche 480, si consigliano provette PCR bianche. Il modulo di rilevamento della fluorescenza si trova sotto il modulo di riscaldamento (lettura del segnale dal basso o laterale): è possibile utilizzare solo provette trasparenti.

• Piastre PCR

Piastre PCR senza bordi: Prive di pannelli laterali, compatibili con la maggior parte degli strumenti PCR e qPCR, facili da tagliare, ma offrono una scarsa stabilità di pipettaggio e richiedono un supporto per piastre; non adatte per applicazioni automatizzate.

Semi-schemate Piastre PCR: Disponibili in vari colori, staccabili, facilitano la classificazione e la gestione dei campioni in esperimenti ad alta produttività, compatibili con etichette o codici a barre e applicazioni automatizzate, e offrono una buona stabilità di pipettaggio.

Completamente schemate Piastre PCR: Presentano bordi con l'altezza totale della piastra, adatte per applicazioni di laboratorio automatizzate, compatibili con etichette e codici a barre, offrono una buona resistenza meccanica, possono essere utilizzate con strumenti PCR con moduli sporgenti, forniscono un'elevata stabilità di pipettaggio e facilitano la movimentazione e lo spostamento da parte di pinze robotiche.

3. In che modo il volume della provetta PCR influisce sui risultati di amplificazione?

• Volume morto

Quando viene aggiunto lo stesso volume di soluzione di reazione, lo spazio sopra la soluzione di reazione (noto anche come volume morto) in una provetta da 0,1 ml è significativamente inferiore rispetto a una provetta da 0,2 ml, con conseguente minore spreco di spazio. Durante l'esperimento, mentre il modulo di riscaldamento dello strumento PCR si riscalda gradualmente, il vapore acqueo generato all'interno della provetta entra nello spazio sopra la soluzione di reazione. La provetta da 0,2 ml ospita più vapore acqueo, portando alla concentrazione della soluzione di reazione. I cambiamenti nella composizione della soluzione di reazione influenzano quindi la conducibilità termica e la temperatura del liquido, influenzando così la stabilità e l'accuratezza dei risultati sperimentali. Al contrario, per una provetta da 0,1 ml, il volume morto è notevolmente ridotto, con una composizione di reazione più stabile e una migliore riproducibilità.

• Condensa sulle pareti della provetta

Poiché il vapore acqueo nella provetta da 0,2 ml deve percorrere una distanza maggiore attraverso la porzione esposta prima di raggiungere il coperchio riscaldato nella parte superiore, porta inevitabilmente alla formazione di condensa sulle pareti della provetta. Ciò è dannoso per gli esperimenti di PCR quantitativa in fluorescenza. Le gocce d'acqua condensate agiscono come minuscole lenti, causando rifrazione e dispersione della fluorescenza, degradando e attenuando la consistenza del segnale del rivelatore e riducendo la sensibilità.

Poiché le provette da 0,1 ml sono completamente racchiuse dal modulo di riscaldamento dello strumento PCR, solo una porzione molto piccola è esposta all'esterno del modulo di riscaldamento e anche la distanza dal coperchio riscaldato è minore. Ciò riduce notevolmente la formazione di condensa sulle pareti della provetta e la possibilità di contaminazione da condensa, ottenendo dati sperimentali più accurati.

• Tasso di cattura della fluorescenza

A causa dei costi sempre più elevati dei reagenti, il volume di reazione nei progetti sperimentali sta diventando sempre più piccolo, più comunemente 20-25 µl. Anche negli esperimenti di PCR quantitativa, non è raro vedere utenti che lavorano con 5-10 µl, che è più che sufficiente per provette da 0,1 ml; anche l'aggiunta di 50 µl è facilmente gestibile.

Per gli strumenti PCR quantitativi a fluorescenza con rilevamento dall'alto, a parità di volume, minore è l'altezza della provetta PCR, minore è la distanza che la luce percorre dalla luce di eccitazione che entra nella soluzione di reazione alla fluorescenza generata che viene ricevuta dal rivelatore (cioè, più breve è il percorso ottico). Ciò si traduce in un tasso di cattura della fluorescenza più elevato da parte del rivelatore e in migliori risultati sperimentali.

Riepilogo

La scelta dei giusti consumabili per PCR richiede un equilibrio tra esigenze sperimentali, compatibilità con lo strumento, prestazioni termiche, proprietà ottiche, integrità della tenuta, controllo della contaminazione e considerazioni sul flusso di lavoro. Decisioni informate portano a test più affidabili, a una riduzione dei fallimenti e a una produttività di laboratorio efficiente.