ПЦР (полимеразная цепная реакция) является одним из наиболее часто используемых методов в молекулярной биологии и диагностических экспериментах. Его точность зависит от множества факторов, включая реакционную систему, настройки прибора и качество расходных материалов. Расходные материалы для ПЦР являются не только контейнерами для реакции, но и напрямую влияют на теплопроводность, потери на испарение, равномерность реакции и воспроизводимость результатов. Выбор правильных расходных материалов может значительно повысить процент успешных экспериментов, а также сократить количество ошибок и затраты.

1. Что такое расходные материалы для ПЦР?

Расходные материалы для ПЦР — это одноразовые лабораторные изделия, специально разработанные для рабочих процессов ПЦР. Эти изделия обычно изготавливаются из высокочистого полипропилена (ПП) и производятся таким образом, чтобы выдерживать многократные температурные циклы, сохраняя при этом химическую стабильность и целостность образца. Они являются важными компонентами в молекулярной биологии, клинической диагностике, генетическом тестировании и исследованиях в области наук о жизни.

Почему расходные материалы для ПЦР обычно изготавливаются из полипропилена (ПП)?

Расходные материалы для ПЦР обычно изготавливаются из полипропилена (ПП), поскольку это биологически инертный материал, его поверхность нелегко адсорбирует биомолекулы, и он обладает хорошей химической стойкостью и термостойкостью (выдерживает автоклавирование при 121 градусе Цельсия и перепады температур во время температурного циклирования). Эти материалы обычно вступают в прямой контакт с реагентами или образцами, поэтому при производстве требуются высококачественные материалы и хорошие технологии обработки.

2. Распространенные типы расходных материалов для ПЦР

• Индивидуальная ПЦР-пробирка

Основные спецификации: ПЦР-пробирки 0,2 мл (с плоской/купольной крышкой); ПЦР-пробирки 0,5 мл (с плоской крышкой).

Плоская крышка обеспечивает точную передачу флуоресцентного сигнала для кПЦР; облегчает маркировку. Купольная крышка контактирует с нагретой крышкой ПЦР-прибора, уменьшая деформацию реакционной пробирки под давлением; однако влияет на передачу флуоресцентного сигнала и не может использоваться в экспериментах кПЦР.

• Полоски ПЦР-пробирок

Основные спецификации:

4-полосные ПЦР-пробирки (прозрачные). 4-полосные ПЦР-стрипы по 0,1 мл с индивидуальными крышками специально разработаны для приборов QIAGEN®/Corbett Rotor-Gene®. 

8-полосные ПЦР-пробирки (ПЦР-полосы с прикрепленными крышками/8-полосные ПЦР-пробирки с отдельными крышками; белые/прозрачные). 

12-полосные ПЦР-пробирки. 

ПЦР-пробирки доступны в основном в трех цветах: прозрачные, матовые и белые. Цвет корпуса пробирки не влияет на амплификацию ДНК. Однако в экспериментах по количественной флуоресцентной ПЦР по сравнению с прозрачными пробирками матовые и белые пробирки уменьшают потери флуоресценции из-за более низкой светопропускаемости, позволяя большему количеству сигналов отражаться обратно в модуль обнаружения флуоресценции, тем самым увеличивая отношение сигнал/шум. Кроме того, белые и матовые стенки пробирок могут лучше предотвращать интерференцию сигналов между лунками, минимизируя вариации в повторных экспериментах.

Модуль обнаружения флуоресценции расположен над нагревательным модулем (считывание сигнала сверху): можно использовать прозрачные, матовые и белые пробирки, но матовые и белые пробирки более предпочтительны; отношение сигнал/шум: белые > матовые > прозрачные; например, для приборов для ПЦР в реальном времени Bio-Rad CFX или Roche 480 рекомендуются белые ПЦР-пробирки. Модуль обнаружения флуоресценции расположен под нагревательным модулем (считывание сигнала снизу или сбоку): можно использовать только прозрачные пробирки.

• ПЦР-пластины

ПЦР-пластины без юбки: не имеют краевых панелей, совместимы с большинством ПЦР- и кПЦР-приборов, легко разрезаются, но обеспечивают низкую стабильность при пипетировании и требуют держателя пластины; не подходят для автоматизированных применений.

С полу-юбкой ПЦР-пластины: доступны в различных цветах, разъемные, облегчают классификацию и управление образцами в высокопроизводительных экспериментах, совместимы с этикетками или штрих-кодами и автоматизированными приложениями, обеспечивают хорошую стабильность при пипетировании.

С полной юбкой ПЦР-пластины: имеют края на всю высоту пластины, подходят для автоматизированных лабораторных применений, совместимы с этикетками и штрих-кодами, обладают хорошей механической прочностью, могут использоваться с ПЦР-приборами, имеющими выступающие модули, обеспечивают высокую стабильность при пипетировании и облегчают захват и перемещение роботизированными манипуляторами.

3. Как объем ПЦР-пробирки влияет на результаты амплификации?

• Мертвый объем

При добавлении одинакового объема реакционной смеси пространство над реакционной смесью (также известное как мертвый объем) в пробирке объемом 0,1 мл значительно меньше по сравнению с пробиркой объемом 0,2 мл, что приводит к меньшим потерям пространства. Во время эксперимента, по мере постепенного нагрева нагревательного модуля ПЦР-прибора, образующийся внутри пробирки водяной пар попадает в пространство над реакционной смесью. Пробирка объемом 0,2 мл вмещает больше водяного пара, что приводит к концентрированию реакционной смеси. Изменения состава реакционной смеси затем влияют на теплопроводность и температуру жидкости, тем самым воздействуя на стабильность и точность результатов эксперимента. И наоборот, для пробирки объемом 0,1 мл мертвый объем значительно уменьшается, что приводит к более стабильному составу реакции и лучшей воспроизводимости.

• Конденсация на стенках пробирки

Поскольку водяной пар в пробирке объемом 0,2 мл должен пройти большее расстояние через открытую часть, прежде чем достичь нагретой крышки вверху, это неизбежно приводит к образованию конденсата на стенках пробирки. Это вредно для экспериментов по количественной флуоресцентной ПЦР. Капли конденсированной воды действуют как крошечные линзы, вызывая преломление и рассеивание флуоресценции, ухудшая и ослабляя согласованность сигнала детектора и снижая чувствительность.

Поскольку пробирки объемом 0,1 мл полностью окружены нагревательным модулем ПЦР-прибора, лишь очень небольшая часть остается снаружи нагревательного модуля, а расстояние до нагретой крышки также короче. Это значительно уменьшает образование конденсата на стенках пробирки и возможность загрязнения из-за конденсата, что приводит к более точным экспериментальным данным.

• Эффективность захвата флуоресценции

Из-за постоянно растущей стоимости реагентов объем реакции в экспериментальных планах становится все меньше и меньше, наиболее распространенным является 20-25 мкл. Даже в экспериментах по количественной ПЦР нередко можно встретить пользователей, работающих с 5-10 мкл, что более чем достаточно для пробирок объемом 0,1 мл; даже добавление 50 мкл легко выполнимо.

Для флуоресцентных количественных ПЦР-приборов с верхним детектированием при одинаковом объеме, чем меньше высота ПЦР-пробирки, тем короче расстояние, которое проходит свет от возбуждающего света, попадающего в реакционную смесь, до генерируемой флуоресценции, принимаемой детектором (т.е. короче оптический путь). Это приводит к более высокой эффективности захвата флуоресценции детектором и лучшим результатам эксперимента.

Резюме

Выбор правильных расходных материалов для ПЦР требует балансирования между потребностями эксперимента, совместимостью с прибором, тепловыми характеристиками, оптическими свойствами, герметичностью уплотнения, контролем загрязнений и соображениями рабочего процесса. Обоснованные решения приводят к более надежным анализам, уменьшению количества сбоев и повышению эффективности работы лаборатории.